2020 Fiscal Year Annual Research Report
Multi-color super-resolution imaging of organelle communications using super-photostable fluorescent dyes
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19H02849
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
多喜 正泰 名古屋大学, 物質科学国際研究センター(WPI), 特任准教授 (70378850)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | オルガネラ相互作用 / オルガネラ染色剤 / 超耐光性蛍光色素 / 超解像イメージング / マルチカラーイメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高い光安定性を有する種々のオルガネラ染色剤の開発，およびオルガネラ相互作用のマルチカラーイメージングに取り組んだ．標的オルガネラはミトコンドリア，リソソーム，および脂肪滴であり，それぞれストークスシフトが異なる蛍光色素を用いて構造修飾を施した．
ミトコンドリアマーカー：前年度開発したビスホスホール骨格の構造最適化を行い，色素の高輝度化およびミトコンドリア内膜に対する選択性の向上を目指した．その結果，ビスホスホール骨格に対してナフチル環を2,3位で縮環させることより輝度が大幅に高くなることがわかった．また，ミトコンドリア局在性官能基であるトリフェニルホスホニウムと色素骨格とのリンカー長はミトコンドリア内膜選択性に大きな影響を与え，炭素鎖10の場合が最も優れた標識能を示した．構造最適化した色素を用いて超解像STEDイメージングを実施したところ，クリステ構造を明瞭に可視化することができた．
リソソームマーカー：リン含有ローダミンPORはストークスシフトが小さい近赤外蛍光色素である．ローダミン骨格のアミノ基上の置換基を改変することにより，リソソーム選択性を付与することに成功した．また，リン原子上にあるフェニル基に対して適切な機能化を施すことにより，任意のオルガネラを標識することが可能になった．
脂肪滴マーカー：前年度開発したチエノ[3,2-b]チオフェン構造をもつ超耐光性の脂肪滴染色剤を用いて脂肪滴動態の長時間ライブイメージングおよびマルチカラーイメージングを実施した．薬剤の投与により脂肪酸エステルの加水分解反応を促進させ，その様子を24時間に渡って観測したところ，大きな脂肪滴の縮小と同時に，小胞体からの新たな脂肪滴形成を捉えることに成功した．また，超解像イメージングにより，小胞体と極微小脂肪滴との相互作用を観察することができた．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画で示した内容に従い，様々なストークスシフトを示す蛍光色素を用いて，各種オルガネラ染色剤を開発し，超解像イメージングや長時間イメージングなどを実現した．例えば超耐光性脂肪滴染色剤LAQ1を用いることにより，脂肪滴形成や分解過程を30秒間隔で24時間以上にわたり追跡し続けることが可能になった．加えて，STEDイメージングにより極微小脂肪滴が小胞体と相互作用している様子を捉えることにも成功している．本成果はACS Mater. Lett誌のFront Coverに採択された．さらに，LAQ1はフナコシ株式会社より，脂肪滴染色剤LipiDyeIIとして市販化されるに至っている．またストークスシフトが小さい色素としてリン含有ローダミンを採用し，任意のオルガネラを染色することにも成功している．本成果については論文投稿中である．これらの研究成果を踏まえ，現在はタンパク質タグの一種であるHalo-tagに結合できる標識剤の開発を行っており，標識タンパク質の細胞内１分子イメージングを着手した段階にある．したがって，当初計画は順調に進展しているといえ，本評価に至った.
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は，前年度まで得られたオルガネラ染色剤を用いて，有用性の検証を進めると共に，オルガネラ相互作用の解析を実施する．まず，共有結合を介したオルガネラ標識能を有する化合物については，プロテオーム解析を行う．まず，色素骨格と結合するポリクローナル抗体を受託で作製する．同時に，蛍光色素がターゲット上に保持されるように，色素周辺にタンパク質と共有結合できる官能基を導入しておく．染色した細胞の破砕液に対して免疫沈降処理を施し，LC-MS/MSからターゲットタンパク質および蛍光標識部位を同定していく．次に，各オルガネラ染色剤についてSTED撮像条件（励起波長，蛍光検出波長，レーザーパワー等）を最適化する．CW-STEDによる超解像画像取得において特に重要なパラメーターは「STEDレーザー強度」と励起用のレーザーパルスと STED 用のレーザー光との間の「遅延時間」である．それぞれの染色剤の組み合わせを考慮し，マルチカラーSTEDイメージングの条件を定める．以上を踏まえ，マルチカラーSTEDイメージングにより，飢餓状態にある細胞について，オルガネラ接触領域における膜間相互作用や脂肪滴が関与するオルガネラ動態を連続的に観察する．
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