2019 Fiscal Year Annual Research Report
Identification and monitoring of the plasmid(s) spreading among different bacteria in natural environments
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19H02869
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| Research Institution | Shizuoka University |
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Principal Investigator |
新谷 政己 静岡大学, 工学部, 准教授 (20572647)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
野尻 秀昭 東京大学, 生物生産工学研究センター, 教授 (90272468)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | プラスミド / 接合伝達 / 遺伝子の水平伝播 / 宿主域 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
日本各地の複数の環境試料（土壌・水圏や家畜堆肥等，下水処理場等，65サンプル）から，自然界で実際に伝播しているプラスミドを，各プラスミドの接合伝達能を指標としたプラスミドキャプチャリングを行って収集した．その結果，730株のプラスミド保有株を取得し，そのうち，70本のプラスミドについて全塩基配列の決定を行った（一部科研費の先進ゲノム支援の支援も受けた）．このうち数の多かったIncP群，PromA群プラスミドについては，その分布についてもPCR－サザンブロット法によって調べ，各環境中に広く分布していることが示された．プラスミドの全塩基配列に基づく分類の結果，既知プラスミドとは，分子系統学的に異なる新たなサブグループのIncP群やPromA群プラスミドが複数得られた．さらに，得られたプラスミドのうち，IncP群やPromA群に属する，サブグループの異なる複数のプラスミドや，先行研究で得られた新規プラスミドpSN1216-29については，自然環境中における宿主域を明らかにするために，プラスミド上に接合完了体でのみ発現する緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子を挿入し，培養可能な細菌の基準株（10-30株程度）に対して接合実験を行うとともに，環境試料より抽出した細菌群集をモデル受容菌群とした接合実験を行った．特にpSN1216-29については，モデル受容菌群からの接合完了体の収集を，フローサイトメーターとセルソーターを用いて行い，その宿主域を明らかにし，その成果を論文にまとめ，投稿した（2020年5月に採択通知）．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当初計画の通り，数多くの自己伝達性プラスミドを環境試料中から取得することに成功し，当初の計画を上回る70本の塩基配列の決定を行った（科研費先進ゲノム支援による支援を受けた）．そのうち，大半については完全長塩基配列も得られた．IncP群プラスミドは，これまでに発見され，塩基配列が明らかになったものだけでも200以上知られているが，本研究では，IncP群のサブグループに属するものの，これらのプラスミドとは系統分類学上，全く異なると予想されるプラスミドも得られた．一方，PromA群プラスミドについても，同様に，これまでに得られたプラスミドと，サブグループの異なる可能性の高いプラスミドが得られた．これらの結果は，本研究で，環境中で実際に伝播しているプラスミドのうち，これまで見過ごされてきたプラスミドを得られたものと考えられた．また，分布調査についても方法を確立し，すでに新たに発見したプラスミドと類縁のプラスミドの分布について調べているところである．一方，伝播経路の解明に必須となる宿主域の比較を，PromA群に属するプラスミドについて現在実施している．また，他のプラスミドについては，当該因子上に緑色蛍光タンパク質GFPをコードする遺伝子の挿入を進めた．既に複数の目的プラスミドの取得に至っており，ほぼ予定通り進行していると考えられる．また，先行研究で得られたpSN1216-29については，その宿主域を決定するに至った．本成果については論文として発表した．
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| Strategy for Future Research Activity |
①引き続き，各環境試料からの自己伝達性プラスミドの収集を，受容菌を変えて行う．また各環境試料から収集した，自己伝達性プラスミドのうち，全塩基配列を決定した新規性の高いプラスミドについては，その分布について調べる．
②取得した新規プラスミドの基本機能の解明：①で得られた新規プラスミドの全塩基配列を基に，各プラスミドの複製・維持・接合伝達を調べる．特に，新たなサブグループに分類されるIncP群やPromA群プラスミドについて，複製や維持機構，接合伝達に寄与する遺伝子，DNA領域（複製開始点，接合伝達開始点等）について，その機能を検証する．
③異なる供与菌を用いた際のプラスミドの宿主域の比較：①で得られたプラスミドの宿主域を比較する．プラスミド上に接合完了体でのみ発現する緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子を挿入し，①で得られたプラスミドがどの細菌に接合伝達可能か明らかにする．並行して，その接合伝達頻度も算出する．また，供与菌として用いる菌株の種類を変えた場合にも同様の実験を行う．基準株には門・綱レベルで異なる細菌を用いるが，網羅性を補完するために，多種多様な細菌を含む土壌や水圏由来の細菌群集をモデル受容菌群とした接合実験も行う．モデル受容菌群からの接合完了体の収集は，研究分担者と共同で，フローサイトメーターとセルソーターを用いて行う．
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