2019 Fiscal Year Annual Research Report
ゲノムの再編成による多様な人工ゲノムを持つ酵母細胞の創成と育種への応用
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19H02878
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| Research Institution | Sojo University |
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Principal Investigator |
原島 俊 崇城大学, 生物生命学部, 教授 (70116086)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
笹野 佑 崇城大学, 生物生命学部, 准教授 (90640194)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 出芽酵母 / ゲノムの再編成 / ゲノム編集 / 人工ゲノム / 染色体複数部位の同時分断 / 染色体複数領域の同時部分重複 / 染色体複数領域の同時欠失 / ゲノムの多様性創出 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
目的の有用物質生産に最適なゲノム（本申請では”ベストゲノム”と呼ぶ）を自在に創製する育種技術の開発は微生物育種工学者の夢であると言っても過言ではない。しかし、”ベストゲノム”が具体的にどのようなゲノムで、それを合理的に設計できる知見が十分でない現在、考えられる戦略のひとつは、既存のゲノムを持つ微生物から出発して、天文学的な種類のゲノム組成を持つ細胞を誘導し、その細胞集団から、目的生産物に最適な”ベストゲノム”を持つ細胞をスクリーニングすることであろう。本研究は、この目的を実現するための技術として、出芽酵母を材料にゲノムの多様性を創り出す様々な技術の開発を目的として行っている。
ゲノムの多様性を創出する方法論はいくつか考えられる。例えば、i) 染色体を分断し(PCS法)、体細胞分裂における不均等分離による多様な組合わせの脱落を利用する方法。あるいは、ii) 染色体の部分重複技術により、多様な部分重複の組合わせを利用する方法 (PCDup法)、あるいは、iii) 染色体の部分欠失や置換の組合わせを利用する方法（PCD/PCRep法）などである。しかし、これらの方法によって多様な人工ゲノムを持つ酵母細胞を効率良く創成するには、１回の形質転換で複数の部位や領域を一挙に操作できることが不可欠である。本プロジェクトの開始までに、PCS法については１回の形質転換により同時に４箇所の染色体部位の分断が可能になっていたが、その他の技術については複数領域の同時操作は可能になっていなかった。そこで初年度は、ゲノム編集技術（CRIPR/Cas9）と我々の技術を融合することによって、一度に複数領域の置換、重複ができるかどうかを検証した。その結果、前者では2領域の同時欠失/置換が、また後者では3領域の同時重複が可能となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに、多様な人工ゲノムを持つ酵母細胞の創出を目指して、染色体の分断(PCS)、部分重複(PCDup)、部分欠失(PCD)、部分置換(PCRep)などのゲノムの多様性創出技術を開発してきた。このうち、本プロジェクトの開始までに、PCS法については１回の形質転換により同時に４箇所の染色体部位の分断が可能になっていたが、その他の技術については、一度の形質転換によって複数領域の同時操作が可能になっていなかった。それが、初年度の成果により、PCDupについては同時に２箇所、PCD/PCRepについては同時に３箇所の領域の操作が可能になったことは、それなりの進展であったと考えている。この進展は、ゲノム編集技術と我々の技術との融合によって、初めて可能になったものであるが、強調しておきたいことは、本研究で開発を行っているゲノムの多様性創出技術はゲノム編集技術だけでは可能ではないことである。しかし、同時複数領域の操作については、もっと多くの領域（例えば４領域あるいは５領域）の同時操作が可能になことが必要である。そうすれば、短期間で、ゲノムの多様性の種類を大幅に増やすことができることが期待される。このことが、まだ達成できていないことは今後の課題であると考え、自己点検としては、最上位の次の区分である、「おおむね順調に進展している」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、少なくとも以下の２つの方法論で、多種多様な人工ゲノム酵母細胞の創成とその応用を目指して行きたいと考えている。そのひとつは、i) PCS に関するもので、これまで一度の形質転換で同時に４箇所の染色体部位の分断に成功している。この成功によって、ゲノムの再編成が大きくスピードアップできることになったが、今後は、さらに少なくとも５箇所、願わくば８箇所の染色体部位の同時分断を可能する技術の確率を目指したい。
次に、ii) PCD、PCDupについては、初年度の成果によって、一度の形質転換で、それぞれ３領域、２領域の同時操作が可能になった。しかし、これでは多様なゲノム組成を持つ人工酵母細胞の効率の良い創成にはほど遠い。従って、今後は、形質転換の選択マーカーをさらに増やす、さらに多量のDNA量を使う、形質転換の方法をリチウム法から、より多くのDNAを導入できるプロトプラスト法に変更するなどを考えている。さらに、特にPCDup 法については、これまで１倍体を使っていたが二倍体を使うことを考えている。その理由は、部分重複が起こるためには、１倍体細胞体細胞を使った場合、染色体の不均等分離が必要であるが、二倍体を用いることで染色体の不均等分離が不要になり、1回の形質転換で複数領域の部分重複を起こす頻度が上昇することが期待できるからである。また、さらに良いことは、二倍体を用いることにより一倍体を用いるよりも、より多様なゲノム組成を持つ人工細胞が取得できると期待されることである。こうした方策によって、一度の形質転換によって、同時に少なくとも染色体の４領域の同時操作を可能にすることを目指したい。
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