2021 Fiscal Year Annual Research Report
ゲノムの再編成による多様な人工ゲノムを持つ酵母細胞の創成と育種への応用
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19H02878
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| Research Institution | Sojo University |
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Principal Investigator |
原島 俊 崇城大学, 生物生命学部, 教授 (70116086)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
笹野 佑 崇城大学, 生物生命学部, 教授 (90640194)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 出芽酵母 / ゲノムの再編成 / ゲノム編集 / 人工ゲノム / 染色体複数部位の同時操作 / 複数ガイドRNAの同時発現 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
目的の有用物質生産に最適なベストゲノムを自在に創製する育種技術の開発を目指して、既存のゲノムを持つ酵母から天文学的な種類のゲノム組成を持つ細胞集団を創成し、その細胞集団から目的生産物の生産に最適な細胞をスクリーニングする技術 (ゲノムの再編成技術)の開発を行ってきた。その結果、昨年度までに、要素技術として、1日で複数のガイドRNA (gRNA)を発現できるDNA断片をPCR技術のみを使って調製できる新しいゲノム工学基盤技術 (gRNA-TES) を確立した。しかし、gRNA-TESでは、複数のgRNA発現断片を混合して酵母細胞に導入する必要があるとの欠点が解決されないままであった。そこで、本年度は、その解決を試みた。
そのため、一つのプロモーターによって複数のgRNAを発現させるようにし、それぞれのgRNAの間に、酵母細胞が持つRNaseによる切断が可能なtRNA遺伝子を挟んで一続きのRNAとして発現できる断片をPCRで調製して酵母細胞内に導入後、それぞれのgRNAが、それぞれの標的にデリバリーできる方法の開発を試みた。この目的のため、複数のgRNAを発現する1つのDNA断片を調製できる Golden Gate Assembly反応（GGA反応）を取り入れた。このようにして開発した新規手法(PCR-gRNA/tRNA法と命名)の有効性を検証するため4箇所の染色体部位を選定し、4種のgRNA発現DNA断片をGGA反応で連結した。別途、4箇所の染色体部位の分断に使用する8種の分断DNAモジュールをPCRで調製した。その後、1種のGGA DNA 断片と8種のDNA分断モジュールを用いて酵母の形質転換を行った。その結果、4箇所の標的が同時に分断された形質転換体を得ることはできなかった。しかし、今後の課題として多量のGGA連結DNA断片を導入するなどの課題が認識された。そうした改良によって、多数箇所（少なくとも10箇所）の同時分断を可能とする新規なゲノム工学技術を構築し、これまで提案されたことのない「ゲノムの再編成技術」を確立したい。
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| Research Progress Status |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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