2019 Fiscal Year Annual Research Report
In vitro construction of bovine endometrium including uterine glands and the study on the machanisms of bovine conceptus development
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19H03105
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
木村 康二 岡山大学, 環境生命科学研究科, 教授 (50355070)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山本 ゆき 岡山大学, 環境生命科学研究科, 助教 (20645345)
松山 秀一 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (50455317)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 子宮腺 / ウシ / 管腔形成 / 胚伸長 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度はウシ子宮腺の体外管腔形成に必要な条件について検討した。食肉センター由来の子宮より子宮上皮層を切除した後、子宮小丘間子宮内膜間質層を採取した。採取後、数ミリ角に組織を細切した後、コラゲナーゼおよびトリプシン溶液により組織を消化した。消化した組織をステンレスメッシュを用いてろ過し、子宮腺組織のみを回収した。回収した組織の多くは断片化していた。この子宮腺組織を50％マトリゲル内に包埋・硬化させた。ゲルの上層には培養液を添加した。なお、培養液ならびにマトリゲル内にはEGF、WNT3,5,7をそれぞれ添加した（EGF+WNT区）。
培養開始後、無添加区（対照区）およびEGF+WNT区の両者において、包埋された子宮腺断片の多くは嚢胞状の形態に変化し（シスト形成）、両区においてその形成率に差は見られなかった。培養開始３日に上記のように形成したシストのみを採取し、再び同条件でマトリゲル内に包埋し培養を継続させたところ、対照区においてはすべてのシストはシストの形態を維持し続けたが、EGF+WNT区においてはその形態は著しく変化し、子宮腺様構造を呈した。次にこの子宮腺様構造の形成過程をタイムラプス顕微鏡を用いて経時的に観察することにより解析した。培養開始後３日で形成されたシストはその後、シスト内腔は消滅して細胞塊を形成し、その後その細胞塊はスパイラルを描くように回転しながら増殖・伸長した。伸長過程において、一時的に内腔を呈することが確認出来た。
また、今年度から子牛にプロジェステロン製剤を投与することにより、子宮腺ノックアウトウシ（UGKOウシ）の作出を試みている。当該年度に生まれた子牛２頭にヒツジにおいて報告されている方法に準してプロジェステロン製剤を投与した。現在処理は終了し、そのまま飼養し、性成熟に達してから実験に供する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度の目標の一つはウシ子宮腺を単離し、これを体外で培養することによって、体外での子宮腺構造の再構成を行うことであった。実績の概要でも示したが、ウシ子宮から単離した子宮腺断片をEGF+WNT存在下のマトリゲル内で包埋培養したところ、子宮腺様構造が出現した。一方、これらの因子の無添加状態ではこの子宮腺様構造の形成が見られないことから、これらの因子が子宮腺様構造の形成に必要であることが明らかとなった。以上の結果は今後の研究推進に必要最低限の条件であり、これを達成できたことから概ね順調に進行していると考えている。
また、子宮腺形成不全ウシ（子宮腺ノックアウトウシ：UGKOウシ）が今後の研究に必要となってくるが、このウシの作出には２年の年月が必要である。研究の一つの問題点はこのUGKOウシ作出の開始であったが、当該年度内に研究をスタートすることが出来た。他の小課題においてもこのように順調に研究が進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和３年度の研究計画としては当該年度に成功した体外形成した子宮腺様構造体の解析を行う。具体的には、子宮腺様構造体を回収し、各種抗体によって免疫染色して体内における子宮腺の染色像と比較する。また、子宮腺様構造体からRNAを抽出し、発現遺伝子についても同じく体内における子宮腺のそれと比較する。また今回は様々な液性因子を子宮腺培養液に添加しているが、それぞれがどのように影響しているのかは定かでない。各因子の子宮腺体外形成にかかわる効果についても検討する。
子宮腺ノックアウトウシ（UGKOウシ）については、性成熟後、正常な発情周期およびは周期中のホルモン動態を把握するとともに、子宮内膜をバイオプシーし、組織学的に子宮腺が消失しているかを確認する。消失していた場合、過剰排卵処置および人工授精後、１４日に子宮潅流によって胚を回収し、胚のサイズを対照牛と比較する。
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