2021 Fiscal Year Annual Research Report
In vitro construction of bovine endometrium including uterine glands and the study on the machanisms of bovine conceptus development
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19H03105
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
木村 康二 岡山大学, 環境生命科学学域, 教授 (50355070)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松山 秀一 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (50455317)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 子宮腺 / ウシ / 管腔形成 / 胚伸長 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．3次元培養によって得られた子宮腺シストならびに子宮腺様構造における細胞種を特定するためにサイトケラチン、ビメンチン抗体で染色を行った。両者においてビメンチンポジティブの細胞は存在せずすべてサイトケラチンポジティブであったことから、シスト、子宮腺様構造とも上皮性の細胞のみで構成されていることが示された。２．子宮腺を採取したｂ所が子宮内膜内のどの部位かによって腺様構造形成に差があるのかを調べるために、子宮内膜浅層ならびに深層のそれぞれから子宮腺を単離し、EGF+WNT存在下でマトリジェル内で培養した。その結果、両者の間でシストならびに子宮腺様構造形成率に差は見られなかった。４．昨年度シストから子宮腺様構造形成の際にEGFは必須であるがWNTは必須でないことが示されたため、単離子宮腺をゲルに包埋直後よりEGFのみで培養したところ、シストの形成は起こらず、直接子宮腺断片から子宮腺様構造が形成することが明らかとなった。またこれはEGF受容体阻害剤によって抑制されることが示された。５．腺様構造、単離子宮腺、シストにおける分泌タンパク質SERPINA14とSPP1遺伝子の発現を比較したところ、単離子宮腺と比較してシストではこれらの発現は有意に上昇したが、腺様構造ではこれらの遺伝子の発現は対照区と比較して有意な差は認められなかった。６．子宮腺ノックアウト牛作出を試みているが、これまでヒツジやマウスで報告された方法に準じて実施した結果、子宮腺のノックアウト個体の作出には至らなかった。当該年度はプロジェステロン量を大幅に増加して投与実験を行い、今年度その個体が性成熟を迎えるので、子宮内膜を採取して子宮腺の存在を確認する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究に必須のマトリゲルの入手が年度内に非常に困難となり（製造が一時的に停止したことによる）、一時的に培養実験が出来なくなった時期があり、研究の進捗に影響を与えた。また、子宮腺様構造が胚に与える影響について本研究では実施することになっているが、子宮腺様構造が従来の子宮腺とかなり性質を異にする可能性が出てきている。例えば子宮腺様構造は細胞が重層化し、部分的に内腔は存在しているが、体内における子宮腺とは異なり、その大部分で管腔形成が行われていないことが示唆されている。EGF添加によって構造自体は作成可能であるが上記の状態であるので、分泌機能は著しく低下している可能性が高い。これらの問題を次年度は解決し、胚との共培養の実験を実施する予定としている。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究からEGFが子宮腺様構造の作出に必須因子であることが明らかとなっているが、腺上皮細胞の性質がその過程で大きく変化していることを示唆する結果が得られている。特に本来単層円柱上皮を形成している子宮腺上皮細胞が重層化や細胞塊を形成していることから、細胞骨格の変化や増殖能がEGFによって影響を受けているとともに、上皮細胞の頂低極性が喪失していると思われる。EGF下流のシグナル経路を考慮に入れて頂低極性を回復させる手法の開発を今年度は実施する。さらにタイムラプス観察により、子宮腺断片から子宮腺様構造が形成される際に、細胞の移動が観察されていることから、細胞遊走に係る因子についてその発現レベルを検討するとともに、それらを抑制することによって体内の子宮腺の構造に類似した子宮腺様構造の構築を試みる。体内と類似した子宮腺様構造が得られた場合は、分泌タンパク質発現の性ステロイドホルモンに対する反応性等を評価するとともに、ウシ胚と体外で再構築された子宮腺とを共培養することにより、胚細胞の増殖や分化に与える影響について検討を加える。
また、昨年度より実施している、子牛へのプロジェステロン過剰投与による子宮腺ノックアウト実験においては、個体の性成熟後、子宮内膜をバイオプシーし、その組織を固定染色して子宮腺の存在の有無を確認する。ノックアウトが成立していた場合、胚伸長への影響を検討するとともに、ノックアウト個体・正常個体の子宮内膜を採取し、RNAseqすることによってその両者で発現が変化している分泌タンパク質の同定を行い、これらタンパク質が体外構築子宮腺で発現しているかどうかについて検討する。
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