2019 Fiscal Year Annual Research Report
Role of a mechanosensitive ion channel PIEZO1 in regeneration of skeletal muscle
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19H03179
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
原 雄二 京都大学, 工学研究科, 准教授 (60362456)
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2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 機械受容イオンチャネル / PIEZO1 / 筋衛星細胞 / 筋再生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、「リン脂質フリッパーゼによるホスファチジルセリンをはじめとするリン脂質の輸送が、機械受容イオンチャネルPIEZO1の活性化を介して、骨格筋再生をもたらす」という作業仮説の実証・深化を目指す。特に骨格筋幹細胞である筋衛星細胞にて高発現するPIEZO1イオンチャネルの役割解明を目的とする。2019年度の研究内容は以下のとおりである。
１）筋衛星細胞からの分化過程における脂質解析およびPIEZO1チャネル活性の検討：各脂質特異的なプローブを用いて、細胞膜への機械刺激に伴い、特異的な膜脂質が刺激部位に集積することを見いだした。その集積とPIEZO1イオンチャネルの意義解明を目指し、現在再構成実験にてイオンチャネル活性への寄与解明を行っている。
２）PIEZO1イオンチャネルにおける、膜脂質相互作用領域の同定：PIEZO1イオンチャネルの活性制御に関わるリン脂質ホスファチジルセリンについて、キメラタンパク質を用いた解析等を通じてその認識部位の同定を行った。その結果、N末端から中央領域にその結合部位があることが示された。
３）PIEZO1イオンチャネルの筋衛星細胞での機能解析：Piezo1遺伝子について、筋衛星細胞特異的ノックアウトマウスを用いて解析を行った。H&E染色などの組織学的解析の結果、筋再生不全が認められたこと、さらに筋衛星細胞の増殖が遅延したことから、PIEZO1は筋衛星細胞の増殖を制御することで、筋再生に重要な役割を果たすことが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度において、PIEZO1とリン脂質の相互作用の解析、およびPiezo1遺伝子欠損マウスの解析を行い、それぞれ順当な結果が得られた。特に遺伝子欠損マウスでは、筋再生能不全が認められたことから、本研究の作業仮説を強く支持するものである。一方で、リン脂質とPIEZO1の相互作用部位については、依然アミノ酸レベルの同定に至っていないことから、構造生物学的な知見、ケミカルバイオロジー的手法等を踏まえて引き続き検討を行いたい。
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| Strategy for Future Research Activity |
2020年度は、上記の研究完遂と共に、以下の研究内容を行う。
３）Piezo1遺伝子欠損マウスのさらなる解析：組織学的解析と共に、幹細胞を単離し1細胞RNA-seq解析を行うことで、PIEZO1の遺伝子発現への役割を明らかにする。また、幹細胞の増殖、分化に関わる因子群について解析することで、PIEZO1の下流経路同定を行う。
４）近接分子ラベル化法による関連因子群の同定：上記実験とともに、タンパク質レベルでの下流因子同定も併せて行う。迅速なタンパク質ラベル化法として開発されたAPEX2
を利用する。内在性PIEZO1にAPEX2を融合させた形で発現する筋芽細胞株を樹立しており、分化誘導後に近接分子をラベル化し、プロテオーム解析により結合因子の網羅的探索を行う。
上記研究３）、４）により同定された因子群について、筋芽細胞を用いたRNA干渉法にてその役割を検証するとともに、絞り込んだ候補因子群について遺伝子欠損マウスの作出を進める。
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