2019 Fiscal Year Annual Research Report
The single-molecule analysis of dynamic regulation of integrin-dependent adhesion processes
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19H03229
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| Research Institution | Kansai Medical University |
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Principal Investigator |
木梨 達雄 関西医科大学, 医学部, 教授 (30202039)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 細胞接着 / インテグリン / Rap1 / talin / kindlin3 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
talin1およびkindlin3の一分子イメージングのため、マウスリンパ球細胞株であるヒトLFA-1を発現させたBAF細胞に、可視化用のhalotagを融合させたtalin1およびkindlin1を作成して発現させたのち、halotag ligandを用いて 一分子レベルで可視化できることを確認した。この細胞を用いてICAM-1との接着過程を一分子計測を行った。その結果、talin1の結合は刺激のない状態では細胞膜への移行は低く、膜滞在時間も1秒以内が大部分であった。インテグリンの接着性を亢進させるPMAを添加し、LFA-1/ICAM-1を介する接着が誘導されると、細胞膜移行頻度と滞在時間の増大がおこること、この変化がLFA-1の発現およびbeta2細胞内領域のトリプトファン（W747)およびNPXFモチーフ依存的に起こっていた。同細胞を用いてLFA-1/ICAM-1結合の一分子計測と比較した結果、talin1の結合時間分布はICAM-1の結合時間分布とほぼ同じであり、結合時間が10秒以上の高親和性結合成分が～10％程度、1秒から10秒未満が20～30%、1秒未満が～70%の頻度であった。高親和性結合の解離速度はおよそ0.05/秒であった。一方、kindlin3は結合頻度、膜滞在時間は短く、Koffは0.11/secとtalin1の2倍の解離速度であった。Crspr/Cas9によってkindlin3を欠損させると、LFA-1/ICAM-1を介する接着が起こらないことから、これらの結果はtalin1の結合がICAM-1結合を決定していること、kindlin3の一過性の結合がLFA-1の活性化に必要であると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
マウスbeta1, beta3, beta7のインテグリン遺伝子をCrspr/Cas9法によって変異を導入し、これらの遺伝子が発現しない状態で測定することによって初めてtalin1, kindlin3のLFA-1の特異的結合動態を測定することができたことから、本課題の実施基盤が確立された。また、talin1とkindlin3の結合動態の違いが初めて明らかになり、talin1が基本的にICAM-1の結合動態を決定していること、kindlin3の一過性結合によってインテグリンが活性化されることが一分子計測によって初めて示されたことの意義は大きい。また刺激があってもICAM-1がない状態ではtalin1, kindlin3の結合レベルが低いことから、ICAM-1結合による細胞内へのシグナル（outside-inシグナル）の重要性が示唆され、今後の解明ポイントが明確になった。方法的には、樹立した細胞を用いて複数のターゲットとシングルセルソーティングを組合せCrspr/Cas9による遺伝子変異を効率よく導入できることが可能になったことから、インテグリン活性化に関与するとされる分子群をtalin1, kindlin3の動態への効果として評価することが迅速に可能となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．Talin1、 Kindlin3の結合動態について、β2インテグリン細胞内領域の変異の効果および、Rap1、 Talin1、Kindlin3の依存関係をknockout/knockdownすることによって明らかにする。また、F-actin阻害、 vinculin、 filamin、 myosin IIA、RIAM等のknockdown/knockoutによる結合動態への効果を明らかにする。さらにTalin1に関してFERMドメインの変異、rodドメインの欠失による効果、Kindlin3についてはFERM/PHドメインの変異を調べる。
２．リンパ球および癌細胞を用いた動態測定
上記で明らかになったRap1活性化からTalin1, Kindlin3の結合動態に影響を与える素過程に着目し、その改変による効果を検証する。介入法としてknockdown/knockoutによる欠損、分子間相互作用部位の変異挿入を検討する。これらの変異を導入したマウスを作成し、リンパ球の血管内皮接着過程、組織内移動、増殖・分化過程を調べる。また、癌細胞として悪性度の高いGlioblastoma (GBM)に着目する。Rap1活性化からTalin1、 Kindlin3の結合動態に影響を与える素過程を改変した細胞株を作成し、in vitroの接着動態、Sphere形成能、移植による腫瘍形成能、浸潤・転移能への効果を明らかにする。
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[Presentation] インテグリン関連疾患治療薬開発に向けた薬剤スクリーニング法の開発,2019
Author(s)
Y Ikeda, N Kondo, H Takeda, Y Makita, Y Fukunishi, Y Ueda, K Sato, M Murayama, B Ma, Y Isaka, K Kawai, T Mashimo, Y Kamioka, M Araki, M Omote and T Kinashi
Organizer
第10回スクリーニング学研究会
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