2019 Fiscal Year Annual Research Report
ミトコンドリアDNAポリメラーゼの多様性と進化の全容解明
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19H03280
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
稲垣 祐司 筑波大学, 計算科学研究センター, 教授 (50387958)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平川 泰久 筑波大学, 生命環境系, 助教 (40647319)
中野 賢太郎 筑波大学, 生命環境系, 教授 (50302815)
石谷 佳之 筑波大学, 計算科学研究センター, 研究員 (60772043)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ミトコンドリア / DNA複製 / 真核生物系統 / DNAポリメラーゼ / オルガネラ進化 / ユーグレノゾア / DNAポリメラーゼI |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ユーグレノゾア生物群は主に、①トリパノソーマ原虫をふくむキネトプラスト類、②ディプロネマ類、③ミドリムシをふくむユーグレナ類から構成される。我々はユーグレノゾアにふくまれる生物種の大規模配列データ中にミトコンドリア局在DNAポリメラーゼ（mt局在DNA pol）を探索した。その結果、ユーグレノゾアにおいては既知のmt局在DNA pol（POP、PolIA、PolIB、PolIC、PolID）に加え、異なる2種類の新奇mt局在DNA polが検出され、複数種類のmt局在DNA polが複雑に分布していた。ユーグレノゾア生物群の中でのキネトプラスト類、ディプロネマ類、ユーグレナ類の分岐順序を鑑みると、上記3系統の分岐に応じてmt局在DNA polのレパートリーが変化したと考えられる。
本研究計画が開始される前から、我々はヘテロロボサ類Naegrelia gruberiゲノム中に発見されたDNAポリメラーゼ（XP_002679000.1）を、新奇mt局在DNA polとして注目していた。2019年度の研究により、同じタイプのDNAポリメラーゼがアンキロモナス類、マラウィモナス類、ディスコバ生物群にも発見された。これらのDNAポリメラーゼN末端配列はミトコンドリア局在シグナルと予測された。
GenBankデータベースに登録されているディスコバ生物群にふくまれるTsukubamonas globosa、アンキロモナス類の配列データのクオリティが低く、注目するmt局在DNA pol候補タンパク全長を復元することができなかった。そこでTsukubamonasとアンキロモナス類Fabomonas sp.について、タンパク質全長の決定を目指し新たにRNA-seqデータを取得した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々の研究により、ユーグレノゾア生物群におけるmt局在DNA polの多様性は以下のように推測された。まずPolIAは上記3系統すべてから検出されたため、ユーグレノゾアの共通祖先でPolIAが確立したと考えられる。PolIBCDはキネトプラスト類特異的mt局在DNA polであること、一部の系統がこれまで認識されていなかったタイプのmt局在DNA polをもつことが判明した。ディプロネマ類は、キネトプラスト類のPolIBCDに進化的に近縁な新奇mt局在DNA polをもつことが明らかとなった。ディプロネマ類とキネトプラスト類は姉妹群関係にあるので、その共通祖先においてPolIAとは異なるmt局在DNA polが確立し、その後多様化したと推測できる。ディプロネマ類ともキネトプラスト類とも異なり、ユーグレナ類はmt局在DNA polとしてPOPをもつことが明らかとなった。この成果は、Pathogens誌に査読付き英文論文として発表した（原田らPathgens 2020 9:257）。
Naegleriaで発見された新奇mt局在DNA pol候補タンパク質の全長配列は、マラウィモナス類1種、ディスコバ生物群2種からも復元できた。これらのタンパク質のN末端アミノ酸配列と緑色蛍光タンパク（GFP）とを融合させ、酵母細胞内で発現させるためのベクター（pYX142-mtGFP）を作製した。また、全長配列が取得できなかったディスコバ生物の1種Tsukubamonasとアンキロモナス類Fabomonas sp.のRNA-seqデータから、新奇mt局在DNA pol候補タンパク質の全長配列を取得することに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
酵母の発現ベクター（pYX142-mtGFP）中で、新奇mt局在DNA pol候補タンパク質遺伝子の5’配列とGFP遺伝子を連結した。今後このベクターを酵母に導入し、融合タンパク質がミトコンドリアに輸送されるかを緑色蛍光で確認する。融合タンパク質がミトコンドリアに局在すれば、GFPに融合したN末端アミノ酸配列はミトコンドリア局在シグナルである、すなわち解析対象タンパク質がmt局在であると解釈できる。TsukubamonasとFabomonasのmt局在DNA pol候補タンパク質については、RNA-seqデータから完全長タンパク質配列が復元できたが発現ベクターの作製には取り掛かっていない。この2配列についても、発現ベクターの作成、酵母細胞内でのGFP融合タンパク質の発現と局在解析を行う。すべての酵母細胞内発現解析が終わった段階で、英文論文の執筆に取り掛かる。
これまで広範な真核生物系統からmt局在DNA polを探索してきたが、マラリア原虫をふくむアピコンプレクサ生物群においては既知のmt局在DNA polは発見できていない。これまでに知られている全てのmt局在DNA polは、進化的に細菌DNAポリメラーゼI（PolI）に近縁である。そこでPolIへのアミノ酸配列相同性を指標に、熱帯熱マラリア原虫Plasmodium falciparumなどのゲノム・転写物データ中に新奇mt局在DNA pol候補を探索する。候補配列を検出できた場合、細胞内局在を確認する実験を計画・実施する。
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[Journal Article] Inventory and Evolution of Mitochondrion-localized Family A DNA Polymerases in Euglenozoa2020
Author(s)
Ryo Harada, Yoshihisa Hirakawa, Akinori Yabuki, Yuichiro Kashiyama, Moe Maruyama, Ryo Onuma, Petr Soukal, Shinya Miyagishima, Vladimir Hampl, Goro Tanifuji, Yuji Inagaki,
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Journal Title
Pathogens
Volume: 9
Pages: 257
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Large DNA virus promoted the endosymbiotic evolution to make a photosynthetic eukaryote2019
Author(s)
Mitsuhiro Matsuo, Atsushi Katahara, Makoto Tachikawa, Yohei Miakuchi, Hideki Noguchi, Atsushi Toyoda, Asao Fujiyama, Yutaka Suzuki, Takayuki Hata, Soichirou Satoh, Takuro Nakayama, Ryoma Kamikawa, Mami Nomura, Yuji Inagaki, Ken-ichiro Ishida, Junichi Obokata
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Journal Title
bioRxiv
Volume: 2019
Pages: -
DOI
Open Access
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