2019 Fiscal Year Annual Research Report
Toward understanding regulatory system of spatial gene expression
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19H03424
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
沖 真弥 京都大学, 医学研究科, 特定准教授 (90452713)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大川 恭行 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (80448430)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 空間トランスクリプトーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
組織特異的な遺伝子発現やエピゲノミクス解析においては、個体や臓器から特定の細胞集団を高い純度で「分取」しなければならない。しかしlaser microdissection法では微小な細胞集団の分離は難しく、cell sortingでは酵素処理で細胞懸濁するさいのダメージは避けられない。本研究はそのような「分取」とは異なる、まったく新たな手法を開発する。これは光開裂型の化学修飾を施したcagedオリゴDNAを組織切片に滴下し、関心領域（ROI）にUV照射後、常法通りのRNA-seqやATAC-seqをおこなうと、ROIだけの遺伝子発現やopen chromatin情報が得られる。原理上、本手法の分離能は光学限界レベルまで引き上げることができ、また少数細胞に特化した既存のゲノミクス手法をわずかに改変したものであるため、感度に優れた汎用性の高い技術として広く利用されることが期待される。
2019年度はUV照射領域に限定可能なRNA-seq法を開発した。まずE14.5 マウス胚を未固定のまま急速凍結して切片を作製し、抗Sox2抗体で免疫蛍光染色することで神経管の正中線をラベルした。つぎにcagedオリゴDNAを滴下して逆転写反応し、ROI（神経管の背側または腹側）のみにUVを照射した。切片の全細胞をproteinase Kで消化してmRNA:cDNAハイブリッドを精製し、その後は、常法のCEL-seq2法にしたがってIVT、ライブラリ合成、シーケンス反応をおこなった。その結果、どのreplicateも１万個ほどの遺伝子が検出された。また約200個の遺伝子がDEGとして検出され、そのうちのいくつかをin situ hybridization法で染色したところ、UV照射領域と一致する発現パターンが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
UV照射領域に限定可能なRNA-seq法の開発に成功したため。
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| Strategy for Future Research Activity |
UV照射領域に限定可能なRNA-seq法およびATAC-seq法の開発をめざす。
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