2020 Fiscal Year Annual Research Report
Insights on the mechanism of mitochondrial diseases
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19H03436
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
北 潔 長崎大学, 熱帯医学・グローバルヘルス研究科, 教授 (90134444)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
稲岡 健ダニエル 長崎大学, 熱帯医学研究所, 准教授 (10623803)
小笠原 絵美 大阪大学, 理学研究科, 助教 (70778274)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ミトコンドリア病 / 呼吸鎖 / 酸化的リン酸化 / 代替経路 / 代謝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
R2年度では、2019年度に作成した細胞の解析を進めた。まず、AOXの特異的な抗体を用いて、ウエスタンブロッティングによりタンパク質の発現が確認されたうえ、免疫染色によりAOXがHeLa細胞のミトコンドリアに局在する事が判った。次に、Antimycin A処理によりコントロールHeLa細胞では酸素消費速度（OCR）が100％阻害されるが、AOX発現HeLa細胞ではOCRが70－80％ほど減少する事から、複合体III-IVによる酸素呼吸がメインであり、AOXの発現量は低いことが示唆された。AOXの発現量を向上させるために、各細胞をAntimycin A(複合体III阻害剤)存在下で培養した。AOX発現しない細胞ではAntimycin A処理により死滅したが、AOX発現細胞はAntimycin Aに耐性を示し増殖が確認された。Antimycin A耐性のAOX発現細胞は、Antimycin A処理にも関わらず高いOCRが観察され、AOXの特異的阻害剤であるAscofuranoneにより、OCRがほぼ100%阻害される事から、複合体III-IVによる酸素呼吸はほとんど行われず、AOXによる酸素呼吸がメインであるが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2020年度に計画していた組換え細胞作成が完了し、HeLa細胞でASCTおよびAOXの発現を確認した。また、AOXの細胞内局在も確認し、ミトコンドリアに局在していることを確認した。また、細胞外フラックスアナライザー解析により、OCRと細胞外酸性化速度（ECAR）の解析も行い、AOXの発現量を向上させる条件を見出した。また、ミトコンドリア病モデル細胞をもちいた組換え細胞の解析も開始できたため「おおむね順調に進展している」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
2020度に引き続き、AOXの発現を向上させたHeLa細胞をもちいて、乳酸や琥珀酸などのエネルギー代謝産物やATPの定量を進める。また、ASCTを発現させたHeLa細胞においても同様に発現量を向上させるために、「G418＋oligomycin A」を用いて組換え細胞をセレクションし、解析を進める。pTurboASCTに関しては、活性が形質転換したHeLa細胞で確認され次第、研究分担者に分与する。
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