2021 Fiscal Year Annual Research Report
炎症性腸疾患の腸管上皮再生過程における大腸幹細胞ニッチの分子基盤の解明
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19H03455
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
佐々木 伸雄 群馬大学, 生体調節研究所, 教授 (30777769)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 潰瘍性大腸炎 / オルガノイド / 幹細胞 / ニッチ / 組織再生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本課題研究は，炎症性腸疾患の新規治療法を開発するために上皮幹細胞に着目した研究を推進している．これまでの研究成果により，炎症障害を受けた上皮細胞では，Lgr5+幹細胞やReg4+ニッチ細胞が消失し，回復期（炎症障害後３－５日後）にかけて残存する上皮細胞で再出現することを見出してきた．そこで，当該年度は，炎症障害を受けた上皮細胞の回復期において，Lgr5+幹細胞またはReg4＋ニッチ細胞を強制的に除去し，上皮組織の回復に影響がみられるか検証した．結果，Lgr5+幹細胞やReg4+ニッチ細胞を除去したマウスは，対照群に比べ上皮組織の回復の遅延が観察された．これらの細胞を除去したマウスにおいて，BrdU取り込み試験や細胞増殖マーカーの発現を確認したところ，腸管上皮細胞の増殖スピードに影響があることが明らかとなった．この結果は，これまでの海外の研究グループの報告とは異なるものであり，新規性の高い成果である．また，炎症障害をあたえ，そこから再生する過程の上皮細胞を回収し，様々な上皮細胞の遺伝子発現についてリアルタイムqPCR法により確認した．炎症障害の程度に比例し，腸管上皮幹細胞や分化細胞のマーカー遺伝子の発現が変化することが明らかになった．
また，当該年度はマウス正常大腸オルガノイド培養法を用いて，炎症障害，またそこからの再生する過程を追跡できるin vitro再現系を構築することに成功した．マウス大腸オルガノイド培地中に，適切な濃度の炎症性サイトカインを一晩添加すると，Lgr5やReg4の発現が極端に低下する．その後，このオルガノイドを通常培地で５日間培養するとLgr5やReg4の遺伝子発現が回復することが分かった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度の成果として，腸管上皮細胞の再生にはLgr5+幹細胞が必須であることを明らかにした．本成果は，これまで報告されていた現象とは反対のものであり，本研究分野においてもインパクトの高い結果であると考えられる．また同様にLgr5+幹細胞を支持するReg4+細胞も腸管上皮細胞の再生過程において重要である事を明らかにすることができた．この障害を受けた腸管上組織が再生する過程において．遺伝子発現パターンを解析した結果，腸管上皮組織における幹細胞ヒエラルキーモデルが適応することが分かった．したがって，今後は特定のシグナル経路に注目することで，腸管上皮細胞の再生を担う分子基盤の理解につながることが期待される．
また，当該年度ではオルガノイドを利用して炎症障害，そして再生過程を再現できるin vitro再現系の構築に成功できたので，上記のin vivo試験と合わせることで，今後より詳細な分子基盤の理解を図れることが期待される．
以上の結果より，当該年度に設定していたマイルストーンは達成されており，来年度以降は腸管上皮細胞の再生過程の分子メカニズムを理解し，実際にそのシグナル経路を操作することで炎症障害からの再生を促せるような新規治療法の開発につなげる研究基盤を構築できたことから，本研究はおおむね順調に進展していると判断した．
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| Strategy for Future Research Activity |
本課題研究の最終年度となる２０２２年度は，これまで我々が構築してきた腸管上皮再生過程を検証するin vivo/in vitro試験を利用して，炎症障害を受けた腸管上皮細胞の再生過程の分子メカニズムの理解を図る．
１． デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘導型大腸炎モデルマウス in vivo試験
自由飲水法で投与したDSSによるマウス腸炎モデルのプロトコルが確立した．DSS投与終了後からの経過日数における腸管上皮細胞の炎症程度や回復程度が安定してきたので，このモデルマウスの腸管上皮組織を回収し，RNA-seq解析を行い再生過程でダイナミックに変動するシグナル経路の同定を目指す．
２．マウス大腸上皮オルガノイドを利用した疑似炎症モデル in vitro試験
これまで我々が独自に開発してきた大腸オルガノイド疑似炎症モデル系を利用して，炎症障害を受けた上皮細胞，ならびに回復期における上皮細胞で観察される遺伝子発現変動解析を行う．炎症障害を与えたオルガノイドを通常培地に戻して培養し，経時的にオルガノイドからRNAを抽出し，RNA-seq解析を実施する．以上の実験より，in vivo/in vitroで共通して変動するシグナル経路を見出し，オルガノイド培養系を利用してそのシグナル経路を操作することで再生過程に変化が観察されるかを検証する．
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