2019 Fiscal Year Annual Research Report
次世代抗体設計に資するマルチスケール解析による二重特異性抗体の超活性化機構の理解
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19H03511
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
熊谷 泉 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 客員教授 (10161689)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田中 良和 東北大学, 生命科学研究科, 教授 (20374225)
真壁 幸樹 山形大学, 大学院理工学研究科, 准教授 (20508072)
浅野 竜太郎 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (80323103)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 二重特異性抗体 / マルチスケール解析 / 次世代抗体設計 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では最先端のマルチスケール解析により、二重特異性抗体で架橋された、がん細胞と免疫細胞のインターフェイスを描像し、空間配置の違いが、如何に細胞間架橋の違いをもたらし、また超高活性化を引き起こすのかを明らかし、さらにその一般性を検証することを目的としている。
本年度は、二重特異性抗体の分子構造の違いがもたらす超高活性化機構の解明に向けて、主に1. 顕微鏡観察による細胞同士の動的会合イベントの理解、および2. クライオ電子顕微鏡を用いた二重特異性抗体-標的抗原複合体の観察、の観点から研究を進めた。
1．顕微鏡観察による細胞同士の動的会合イベントの理解
光学顕微鏡のタイムラプス観察により、二重特異性抗体の添加による、がん細胞、T細胞の動的挙動を観察し、低活性型と超高活性型構造の違いがもたらす、がん細胞への相互作用様式の違いを明らかにすることを目指した。がん細胞、およびT細胞株を播種したプレートに、二重特異性抗体を添加し、個々の細胞の動的挙動と、がん細胞殺傷の過程を光学顕微鏡で経時観察した。結果、より詳細な結果を得るためには播種密度、添加する抗体濃度、さらには反応時間など詳細な条件検討を行う必要があることが明らかになった。
2．クライオ電子顕微鏡を用いた二重特異性抗体-標的抗原複合体の観察
クライオ電子顕微鏡を用いて、二重特異性抗体と標的抗原との複合体を観察することで、超高活性化をもたらした空間的配置の詳細を描像することを目指した。まず測定条件を決定するために、Fabをモデルとして使用し、標的抗原との複合体の透過電子顕微鏡ネガティブ染色法による観察を行った。結果、報告されているX線結晶構造と極めて類似した像が得られ、二重特異性抗体の分子構造の違いを議論するに足る解像度であることが明らかになった。今後、分子構造が異なる二重特異性抗体を用いた透過電子顕微鏡観察へと進める予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、二重特異性抗体の分子構造の違いがもたらす超高活性化機構の解明に向けて、主に1. 顕微鏡観察による細胞同士の動的会合イベントの理解、および2. クライオ電子顕微鏡を用いた二重特異性抗体-標的抗原複合体の観察、の観点から研究を進めた。
1.に関しては、標的抗原が陽性のがん細胞、およびT細胞株をそれぞれ播種したプレートに、二重特異性抗体を添加し、個々の細胞の動的挙動と、がん細胞殺傷の過程を光学顕微鏡で経時観察した。しかしながら、二重特異性抗体の有無や濃度の違いによる、各々の細胞の動的協働の違いの詳細を議論するためには、測定条件を種々の観点から最適化する必要があることが明らかになった。一方、2.に関しては、測定条件を決定するために、使用する二重特異性抗体の元抗体であるFabをモデルとして使用し、標的抗原との複合体の透過電子顕微鏡ネガティブ染色法による観察を行った結果、二重特異性抗体の分子構造の違いを議論するに足る解像度であることが明らかになった。この成果を原著論文に纏めると共に、分子構造の違いによりがん細胞傷害活性が異なる二重特異性抗体をそれぞれ用いた透過電子顕微鏡観察へと現在展開させている。以上より、研究の進捗を総合的に判断し、おおむね順調に進展している、とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.に関しては、それぞれの細胞種や播種密度、添加する抗体濃度、さらには反応時間などの検討を行う。特に、T細胞株に関して、正常T細胞の使用も視野に入れて進め、二重特異性抗体の分子構造の違いがもたらす細胞間架橋能の違いの理解を目指す予定である。
2.に関しては、実際に分子構造の違いによりがん細胞傷害活性が異なる二重特異性抗体をそれぞれ用いて透過電子顕微鏡観察を行う。二重特異性抗体は、これまでに研究グループ内で最も多くの研究実績がある低分子型とし、かつ調製途中での解離等による副生成物の混在を低減させるために一本鎖化した分子を中心に用いる。分泌発現能に優れ、高収量も期待されるグラム陽性菌であるブレビバチルス菌を用いた生産系も適宜利用する。得られた結果をもとに、より原子レベルでの解析に向けたクライオ電子顕微鏡観察のための測定条件を決定する。
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[Journal Article] Build-up functionalization of anti-EGFR × anti-CD3 bispecific diabodies by integrating high-affinity mutants and functional molecular formats2020
Author(s)
Asano R., Hosokawa K., Taki S., Konno S., Shimomura I., Ogata H., Okada M., Arai K., Nakanishi T., Onitsuka M., Omasa T., Umetsu M., Kumagai I.
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 10 (1)
Pages: 4913
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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