Development of novel gene therapy system for genetic hematological disorders by using stealth RNA vector

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19H03613
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 高田 英俊 筑波大学, 医学医療系, 教授 (70294931)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 遺伝子治療 / ステルス型RNAウイルスベクター / 重症複合免疫不全症

Outline of Annual Research Achievements

ステルス型RNAベクター（SRV）を用いて造血幹細胞／前駆細胞をターゲットとして、遺伝子治療開発研究を行った。マウス骨髄からLineage-細胞をマイクロビーズを用いて純化し、セルソーターでlineage-c-kit+sca-1+細胞を分離することで、マウス造血幹細胞／造血前駆細胞を得た。この細胞に対してSRVを用いて遺伝子導入したところ、MOI3～4でGFP陽性率30%前後と、極めて良好な遺伝子導入効率が得られることを確認した。Methocult m3434を用いてコロニーアッセイを行ったところ、顆粒球系コロニーが観察された。遺伝子導入したマウス造血幹細胞／前駆細胞を放射線照射したNOGマウスに静脈内投与し、血球の分化増殖を期待しているが、現時点では不十分な結果しか得られていない。遺伝子導入後の細胞の分化・増殖が安定していない可能性があると考えている。SRVベクターは遺伝子発現量が極めて高いため、細胞の安定性に問題が生じている可能性があり、現在、ベクターを調整中である。
ヒト臍帯血からマイクロビーズで純化し、SRVを感染させたところ、MOI10で、GFP陽性率90%と極めて高い遺伝子導入効率が確認された。この細胞を用いたコロニーアッセイでも、造血系細胞のコロニー産生が確認できた。長期的にin vitroで培養すると、マウスの細胞よりもヒト臍帯血造血幹細胞／前駆細胞が遺伝子導入後の細胞機能の安定性が高いことが確認できた。
東北大学免疫学の教室石井直人教授よりヒト由来共通γ鎖欠損株であるED40515細胞を供与いただき、この細胞に共通γ鎖をSRVを用いて遺伝子導入したところ、IL-2刺激によりSTAT5のリン酸化がWestern blotで確認することができ、受容体からのシグナル伝達が正常におこることを確認することができた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究協力者である産業技術総合研究所／ときわバイオの中西真人先生や筑波大学蛍光バイオイメージング研究室の三輪佳宏先生とは、定期的に研究内容についての会議を開催している。若干ウイルスの調整に時間を要したが、マウスの手配や、ヒト臍帯血の提供先など順調に研究推進に向けた基盤が構築できた。実際にマウスの造血幹細胞の純化や、実際の遺伝子導入、NOGマウスのirradiation、NOGマウスへの遺伝子導入細胞の投与などは順調に行う事ができた。In vitro解析としてコロニーアッセイを繰り返し行っているが、まだ若干、結果が不安定なところがある。この点については、遺伝子発現レベルが高すぎるベクターを用いると、細胞増殖の安定性が見られない事がわかってきた。
幸いな事に、ヒト由来の共通γ鎖を欠損したCell lineを東北大学免疫学教室の石井直人教授から供与していただくことができ、遺伝子導入による蛋白の機能解析を進めることができた。
研究で用いる大型機器は、ほとんど筑波大学内のオープンファシリティーシステムにあるため、研究が順調に進行した。マウスを用いた実験は、研究環境の整備された筑波大学内の動物資源センターで順調に進めることができた。

Strategy for Future Research Activity

遺伝子治療研究で重要な点は、ベクターの機能性であり、遺伝子導入効率や遺伝子導入後の細胞機能の安定性・再現性である。それに向けて、ベクターも最善の形へと適宜改変されるべきである。これまでの研究によりマウスの造血幹細胞／造血前駆細胞と比較して、ヒトのCD34陽性細胞のほうが、より遺伝子導入効率が良く、細胞の安定性も高いことがわかってきた。この結果を踏まえ、研究協力者と協議し、in vitroおよびin vivoの遺伝子導入効果を繰り返し観察するとともに、さらに安定した遺伝子導入が得られるようなベクターの改変も行う事にした。
今後、in vivoのデータを充実させ、NOGマウスにおける細胞分化を観察したデータを出すことを中心として研究を進めたいと考えている。

Research Products

• [Journal Article] Novel ARX Mutation Identified in Infantile Spasm Syndrome Patient (2020)
  • Author(s): Takeshita Y, Ohto T, Enokizono T, Tanaka M, Suzuki H, Fukushima H, Uehara T, Takenouchi T, Kosaki K, Takada H
  • Journal Title: Hum Genome Var Volume: 7 Pages: -
  • DOI: 10.1038/s41439-020-0094-2
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Quantitative Assessment of Fine Motor Skills in Children Using Magnetic Sensors (2020)
  • Author(s): Enokizono T, Ohto T, Tanaka M, Maruo K, Sano Y, Kandori A, Takada H
  • Journal Title: Brain Dev Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2020.03.004
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Outcomes of Paediatric Out-Of-Hospital Cardiac Arrest According to Hospital Characteristic Defined by the Annual Number of Paediatric Patients With Invasive Mechanical Ventilation: A Nationwide Study in Japa (2020)
  • Author(s): Kido T, Iwagami M, Yasunaga H, Abe T, Enomoto Y, Matsui H, Fushimi K, Takada H, Tamiya N
  • Journal Title: Resuscitation Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1016/j.resuscitation.2019.12.020
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Urgent Proton Beam Therapy With Interinstitutional Transfer for Patients With Intracranial Rhabdomyosarcoma: Report of 3 Cases (2020)
  • Author(s): Inaba M, Nakao T, Hosaka S, Suzuki R, Fukushima H, Yamaki Y, Saito T, Sakashita S, Noguchi M, Minami M, Masumoto T, Mizumoto M, Sakurai H, Fukushima T, Takada H
  • Journal Title: J Pediatr Hematol Oncol Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1097/MPH.0000000000001620
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Patient Transfer to Receive Proton Beam Therapy During Intensive Multimodal Therapy Is Safe and Feasible for Patients With Newly Diagnosed High-risk Neuroblastoma (2020)
  • Author(s): Hosaka S, Fukushima H, Nakao T, Suzuki R, Yamaki Y, TanakaK, Saito T, Mizumoto M, Sakurai H, Takashi Fukushima T, Takada H
  • Journal Title: J Pediatr Hematol Oncol Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1097/MPH.0000000000001570
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A Case of Autism Spectrum Disorder With Cleft Lip and Palate Carrying a Mutation in Exon 8 of AUTS2 (2019)
  • Author(s): Saeki S, Enokizono T, Imagawa K, Fukushima H, Kajikawa D, Sakai A, Tanaka M, Ohto T, Suzuki H, Uehara T, Takenouchi T, Kosaki K, Takada H
  • Journal Title: Clin Case Rep Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1002/ccr3.2377
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Lipidomics Links Oxidized Phosphatidylcholines and Coronary Arteritis in Kawasaki Disease (2019)
  • Author(s): Nakashima Y, Sakai Y, Mizuno Y, Furuno K, Hirono K, Takatsuki S, Suzuki H, Onouchi Y, Kobayashi T, Tanabe K, Hamase K, Miyamoto T, Aoyagi R, Arita M, Yamamura K, Tanaka T, Nishio H, Takada H, Shouichi Ohga S, Hara T
  • Journal Title: Cardiovasc Res Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1093/cvr/cvz305
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Decision-making Dilemmas of Paediatricians: A Qualitative Study in Japan (2019)
  • Author(s): Sasazuki M, Yasunari Sakai Y, Kira R, Toda N, Ichimiya Y, Akamine S, Torio M, Ishizaki Y, Sanefuji M, Narama M, Itai K, Hara T, Takada H, Kizawa Y, Ohga S
  • Journal Title: BMJ Open . Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1136/bmjopen-2018-026579
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Neonatal Outcomes of Very Low Birthweight Infants Born to Mothers With Hyperglycaemia in Pregnancy: A Retrospective Cohort Study in Japan (2019)
  • Author(s): Hitaka D, Morisaki N, Miyazono Y, Piedvache A, Nagafuji M, Takeuchi S, Kajikawa D, Kanai Y, Saito M, Takada H
  • Journal Title: BMJ Paediatr Open Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1136/bmjpo-2019-000491
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A Novel Missense PTEN Mutation Identified in a Patient With Macrocephaly and Developmental Delay (2019)
  • Author(s): Y, Enokizono T, Fukushima H, Ohto T, Imagawa K, Tanaka M, Sakai A, Suzuki H, Uehara T, Takenouchi T, Kosaki K, Takada H
  • Journal Title: Hum Genome Var Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1038/s41439-019-0056-8
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] MOB1 Regulates Thymocyte Egress and T-cell Survival in Mice in a YAP1-independent Manner (2019)
  • Author(s): Kato W, Nishio M, To Y, Togashi H, Mak TW, Takada H, Ohga S, Maehama T, Suzuki A
  • Journal Title: Genes Cells Volume: 24 Pages: 485-495
  • DOI: 10.1111/gtc.12704
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Plasma Concentration of Tamoxifen and Its Metabolites in a Neonate and Mother Receiving Tamoxifen: A Case Report of a Pregnant Woman (2019)
  • Author(s): Konishi K, Miyazono Y, Doki K, Kido T, HitakaD, Kanai Y, Takada H, Homma M
  • Journal Title: Ther Drug Monit Volume: 41 Pages: 405-406
  • DOI: 10.1097/FTD.0000000000000608
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Establishment of Immunity Against Epstein-Barr Virus Infection in a Patient With CHARGE/complete DiGeorge Syndrome After Peripheral Blood Lymphocyte Transfusion (2019)
  • Author(s): Hosaka S, Chie Kobayashi C, Saito H, Imai-Saito A, Suzuki R, Iwabuchi A, Kato Y, Jimbo T, Watanabe N, Onodera M, Imadome K, Masumoto K, Nanmoku T, Fukushima T, Kosaki K, Sumazaki R, Takada H
  • Journal Title: Pediatr Transplant Volume: 23 Pages: -
  • DOI: 10.1111/petr.13424. Epub 2019 Apr 29
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Epstein-Barr Virus-Associated γδ T-Cell Lymphoproliferative Disorder Associated With Hypomorphic IL2RG Mutation (2019)
  • Author(s): 9.Tanita, K., Hoshino, A., Imadome, K. I., Kamiya, T., Inoue, K., Okano, T., Yeh, T. W., Yanagimachi, M., Shiraishi, A., Ishimura, M., Schober, T., Rohlfs, M., Takagi, M., Imai, K., Takada, H., Ohga, S., Klein, C., Morio, T., & Kanegane, H
  • Journal Title: Front Pediatr Volume: 4 Pages: -
  • DOI: 10.3389/fped.2019.00015
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Procalcitonin Levels Predicting the Infliximab Response of Immunoglobulin Resistant Kawasaki Disease (2019)
  • Author(s): 10.Nakashima, Y., Nanishi, E., Yamamura, K., Uike, K., Terashi, E., Hirata, Y., Nagata, H., Morihana, E., Tanaka, T., Honjo, S., Takada, H., & Ohga, S. (2019). Procalcitonin levels predicting the infliximab response of immunoglobulin resistant Kawasaki disease.
  • Journal Title: Cytokine Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1016/j.cyto.2018.11.025
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Early canakinumab therapy for the sensorineural deafness in a family with Muckle-Wells syndrome due to a novel mutation of NLRP3 gene (2019)
  • Author(s): 11.Iida, Y., Wakiguchi, H., Okazaki, F., Nakamura, T., Yasudo, H., Kubo, M., Sugahara, K., Yamashita, H., Suehiro, Y., Okayama, N., Hashimoto, K., Iwamoto, N., Kawakami, A., Aoki, Y., Takada, H., Ohga, S., & Hasegawa, S
  • Journal Title: Clinical rheumatology Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1007/s10067-018-4331-8
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 緊急対応を要する原発性免疫不全症 診断への最短コースと初期対応 (2019)
  • Author(s): 高田英俊
  • Organizer: 第122回日本小児科学会学術集会
  • Invited
• [Presentation] 予防接種と免疫不全 (2019)
  • Author(s): 高田英俊
  • Organizer: 第657回日本小児科学会東京地方会