Development of novel gene therapy system for genetic hematological disorders by using stealth RNA vector

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19H03613
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 高田 英俊 筑波大学, 医学医療系, 教授 (70294931)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 遺伝子治療 / ステルス型RNAウイルスベクター / 重症複合免疫不全症

Outline of Annual Research Achievements

ステルス型RNAベクター（SRV）を用いてヒトおよびマウスの造血幹細胞／前駆細胞，即ち，ヒト臍帯血CD34陽性細胞およびマウスのlineage-c-kit+sca-1+細胞をターゲットとして、遺伝子治療開発研究を継続している。いずれも高い遺伝子導入効率が得られることを再確認し，Methocult m3434を用いたコロニーアッセイの結果，遺伝子を導入した造血系前駆細胞は増殖能および分化能を有していることが確認できた。特に，ヒト臍帯血由来CD34陽性細胞では、MOI 10で、GFP陽性率90%と極めて高い遺伝子導入効率が確認された。長期的にin vitroで培養すると、マウスの細胞よりもヒト臍帯血造血幹細胞／前駆細胞が遺伝子導入後の細胞機能の安定性が高いことが確認できた。また，ヒト由来共通γ鎖欠損ED40515細胞に共通γ鎖をSRVを用いて遺伝子導入したところ、IL-2刺激によりSTAT5のリン酸化が確認することができ、受容体からのシグナル伝達が正常におこることを確認できた。他方，遺伝子を導入した細胞を長期的に培養すると，導入した遺伝子の発現を維持する事が難しい場合があるという事がわかり，以前用いていたベクターとは異なる結果となった。遺伝子導入したマウス造血幹細胞／前駆細胞を放射線照射したNOGマウスに静脈内投与した結果では，現時点では不十分血球増殖しか得られていない。遺伝子導入した細胞のRNA Seq解析を行ったところ，遺伝子非導入細胞と比較すると，若干細胞増殖や細胞死に関連する遺伝子発現に差が見られ，遺伝子導入後の細胞の分化・増殖が安定していない可能性がある。SRVベクターは遺伝子発現量が極めて高い事やベクターに搭載している蛍光遺伝子に問題がある可能性があり，これらの点を改良したベクターで研究を継続する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

マウスの造血幹細胞の純化や、実際の遺伝子導入、NOGマウスのirradiation、NOGマウスへの遺伝子導入細胞の投与などは順調に行う事ができ，特にヒトCD34陽性細胞では安定した遺伝子導入が可能である事がわかってきた。共通γ鎖欠損細胞に遺伝子導入することによって機能が回復することも確認できた。遺伝子導入後の細胞の変化についてRNA Seqによる検討を行ったところ，若干細胞増殖や細胞死関連の遺伝子発現に影響が見られ，遺伝子導入後の細胞の安定性を得るためにもベクターのさらなる改良を行う事にした。このように，ベクターの特徴や遺伝子導入後の細胞の変化などについて詳細な解析ができていると考えている。研究で用いる大型機器は、ほとんど筑波大学内のオープンファシリティーシステムにあるため、研究が順調に進行している。マウスを用いた実験は、研究環境の整備された筑波大学内の動物資源センターで順調に進めることができた。研究協力者である産業技術総合研究所／ときわバイオの中西真人先生や筑波大学蛍光バイオイメージング研究室の三輪佳宏先生とは、定期的に研究内容についての会議を開催している。

Strategy for Future Research Activity

現在のベクターを用いて，遺伝子修復への橋渡しを行うことも可能であると考えられる。特に，放射線感受性の高い重症複合免疫不全症患者の造血系細胞は増殖が不安定であり，このベクターを用いて細胞増殖を安定化し，遺伝子修復につなげることが可能であると考え実際に研究に着手している。ベクター自体のさらなる改良も平行して行っており，近く完成予定である。今後は，新たなベクターを用いて，遺伝子導入を行い，遺伝子導入した造血系前駆細胞を用いた研究を行っていく方針である。

Research Products

• [Journal Article] A Case of omalizumab-associated eosinophilic granulomatosis with polyangiitis. (2021)
  • Author(s): Yamaki Y, Hayashi D, Honda K, Imai H, Takada H.
  • Journal Title: Pediatr Int Volume: in press
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Severe adenovirus type F enteritis in a young child with acute myeloid leukemia. (2021)
  • Author(s): Yamazaki-Suda A, Fukushima H, Suzuki R, Yamaki Y, Takada H
  • Journal Title: Pediatr Int Volume: in press
  • DOI: 10.1111/ped.14461
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Short-term intensive gastrointestinal endoscopy training program. (2021)
  • Author(s): Morita A, Kudo T, Horiuchi A, Kajiyama M, Tanaka N, Takada H.
  • Journal Title: Pediatr Int Volume: in press
  • DOI: 10.1111/ped.14721
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Pneumococcal serotype-specific opsonophagocytic activity in interleukin-1 receptor-associated kinase 4-deficient patients. (2021)
  • Author(s): Uehara T, Morino S, Oishi K, Nakamura Y, Togashi N, Imaizumi M, Nishimura S, Okada S, Yara A, Fukushima H, Imagawa K, Takada H.
  • Journal Title: Pediatr Infect Dis J Volume: 40 Pages: 460-463
  • DOI: 10.1097/INF.0000000000003060
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Effectiveness of water jelly ingestion for both rehabilitation and prevention of aspiration pneumonia in elderly patients with moderate to severe dysphagia. (2021)
  • Author(s): Morita A, Horiuchi A, Horiuchi I, Takada H.
  • Journal Title: J Clin Gastroenterol Volume: 2021 Jan 19
  • DOI: 10.1097/MCG.0000000000001493
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Utilization of a novel Sendai virus vector in ex vivo gene therapy for hemophilia A. (2021)
  • Author(s): Yamaki Y, Fukushima T, Yoshida N, Nishimura K, Fukuda A, Hisatake K, Aso M, Sakasai T, Kijima-Tanaka J, Miwa Y, Nakanishi M, Sumazaki R, Takada H
  • Journal Title: Int J Hematol Volume: 113 Pages: 493-499
  • DOI: 10.1007/s12185-020-03059-6
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A case of fetal-onset type 3 familial hemophagocytic lymphohistiocytosis surviving without severe complications after early diagnosis and treatment. (2021)
  • Author(s): Matsumoto T, Fukushima H, Fujiyama S, Nagatomo K, Hosaka S, Suzuki R, Yamaki Y, Kanai Y, Shibata H, Yasumi T, Isshiki K, Kato M, Miyazono Y, Takada H.
  • Journal Title: Pediatr Blood Cancer Volume: Mar 26:e29016. Pages: 1-4
  • DOI: 10.1002/pbc.29016
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Detailed analysis of Japanese patients with adenosine deaminase 2 deficiency reveals characteristic elevation of type II interferon signature and STAT1 hyperactivation. (2021)
  • Author(s): Nihira H, Izawa K, Ito M, Umebayashi H, Okano T, Kajikawa S, Nanishi E, Keino D, Murakami K, Isa-Nishitani M, Shiba T, Honda Y, Hijikata A, Yasu T, Kubota T, Hasegawa Y, Kawashima Y, Nakano N, Takada H, et al.
  • Journal Title: J Allergy Clin Immunol Volume: S0091-6749(21) Pages: 00157-3
  • DOI: 10.1016/j.jaci.2021.01.018
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cognitive functions of pediatric brain tumor survivors treated with proton beam therapy: A case series. (2021)
  • Author(s): Hidaka K, Fukushima H, Hosaka S, Muroi A, Yamamoto T, Mizumoto M, Sakurai H, Takada H
  • Journal Title: J Pediatr Hematol Oncol Volume: 43 Pages: 475-481
  • DOI: 10.1097/MPH.0000000000002011
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Novel ACOX1 mutations in two siblings with peroxisomal acyl-CoA oxidase deficiency. (2021)
  • Author(s): Morita A, Enokizono T, Ohto T, Tanaka M, Watanabe S, Takada Y, Iwama K, Mizuguchi T, Matsumoto N, Morita M, Takashima S, Shimozawa N, Takada H.
  • Journal Title: Brain Dev Volume: S0387-7604(20) Pages: 30291-6
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2020.10.011
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] IRAK4 deficiency presenting with anti-NMDAR encephalitis and HHV6 reactivation. (2021)
  • Author(s): Nishimura S, Kobayashi Y, Ohnishi H, Moriya K, Tsumura M, Sakata S, Mizoguchi Y, Takada H, Kato Z, Sancho-Shimizu V, Picard C, Irani SR, Ohara O, Casanova JL, Puel A, Ishikawa N, Okada S, Kobayashi Masao.
  • Journal Title: J Clin Immunol Volume: 41 Pages: 125-135
  • DOI: 10.1007/s10875-020-00885-5
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Nationwide survey of late-onset hemolysis in very low birth weight infants. (2021)
  • Author(s): Miyazono Y, Arai J, Kanai Y, Hitaka D, Kajikawa D, Takeuchi S, Nagafuji M, Fujiyama S, Saito M, Takada H.
  • Journal Title: Pediatr Int Volume: 63 Pages: 172-176
  • DOI: 10.1111/ped.14493
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Poststreptococcal acute glomerulonephritis in a girl with renal cell carcinoma: possible pathophysiological association. (2021)
  • Author(s): Kageyama A, Fukushima H, Usui J, Iwabuchi A, Suzuki R, Masumoto K, Oda T, Nagata M, Takada H.
  • Journal Title: CEN Case Rep Volume: Feb;10(1) Pages: 139-144
  • DOI: 10.1007/s13730-020-00526-1
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A case of cardiac tamponade without cardiac tumor in pediatric lymphoma. (2020)
  • Author(s): Okuwaki H, Kido T, Enomoto Y, Suzuki R, Takada H
  • Journal Title: Pediatr Int Volume: 62 Pages: 1201-1202
  • DOI: 10.1111/ped.14280.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A follow-up report of an infant born to a mother receiving tamoxifen. (2020)
  • Author(s): Okada Y, Hitaka D, Kido T, Kanai Y, Konishi K, Doki K, Katayama N, Homma M, Miyazono Y, Takada H.
  • Journal Title: Case Rep Pediatr Volume: Jul 26 Pages: 2020:2056756
  • DOI: 10.1155/2020/2056756
  • Open Access
• [Journal Article] Quantitative assessment of fine motor skills in children using magnetic sensors. (2020)
  • Author(s): Enokizono T, Ohto T, Tanaka M, Maruo K, Sano Y, Kandori A, Takada H
  • Journal Title: Brain Dev Volume: 42 Pages: 421-430
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2020.03.004
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A family with Gitelman syndrome with asymptomatic phenotypes while carrying reported SLC12A3 mutations. (2020)
  • Author(s): Ishikawa M, Tada Y, Tanaka H, Morii W, Inaba M, Takada H, Mori T, Noguchi E
  • Journal Title: Case Rep Nephrol Dial Volume: 10 Pages: 71-78
  • DOI: 10.1159/000507845
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Successful trans-maternal nadolol pharmacotherapy in a fetus presenting with long QT syndrome type 2 complicated by torsade de pointes. (2020)
  • Author(s): Shima Y, Horigome H, Nozaki Y, Lin L, Ishiodori T, Yano Y, Takahashi M, Murakami T, Yamasaki H, Taskada H.
  • Journal Title: J Cardiol Cases Volume: 22 Pages: 265-268
  • DOI: 10.1016/j.jccase.2020.07.006
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Novel ARX mutation identified in infantile spasm syndrome patient. (2020)
  • Author(s): Takeshita Y, Ohto T, Enokizono T, Tanaka M, Suzuki H, Fukushima H, Uehara T, Takenouchi T, Kosaki K, Takada H.
  • Journal Title: Hum Genome Var Volume: 7:9 Pages: 1-3
  • DOI: 10.1038/s41439-020-0094-2
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Outcomes of paediatric out-of-hospital cardiac arrest according to hospital characteristic defined by the annual number of paediatric patients with invasive mechanical ventilation: A nationwide study in Japan. (2020)
  • Author(s): Kido T, Iwagami M, Yasunaga H, Abe T, Enomoto Y, Matsui H, Fushimi K, Takada H, Tamiya N.
  • Journal Title: Resuscitation Volume: 148 Pages: 49-56.
  • DOI: 10.1016/j.resuscitation.2019.12.020
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Patient transfer to receive proton beam therapy during intensive multimodal therapy is safe and feasible for patients with newly diagnosed high-risk neuroblastoma. (2020)
  • Author(s): Hosaka S, Fukushima H, Nakao T, Suzuki R, Yamaki Y, Tanaka K, Saito, Mizumoto M, Sakurai H, Fukushima T, Takada H
  • Journal Title: J Pediatr Hematol Oncol Volume: 42 Pages: e18-e24
  • DOI: 10.1097/MPH.0000000000001570
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Urgent proton beam therapy with interinstitutional transfer for patients with intracranial rhabdomyosarcoma: Report of 3 Cases. (2020)
  • Author(s): Inaba M, Nakao T, Hosaka S, Suzuki R, Fukushima H, Yamaki Y, Saito T, Sakashita S, Noguchi M, Minami M, Masumoto T, Mizumoto M, Sakurai H, Fukushima T, Takada H.
  • Journal Title: J Pediatr Hematol Oncol Volume: 42 Pages: e12-e17
  • DOI: 10.1097/MPH.0000000000001620
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 原発性免疫不全症の病態と治療の展開 (2021)
  • Author(s): 高田英俊
  • Organizer: 日本免疫不全・自己炎症学会
  • Invited
• [Presentation] Hematopoietic stem cell transplantation for inborn errors of immunity in Japan: overview of a nationwide retrospective analysis. (2020)
  • Author(s): Miyamoto S, Yanagimachi M, Umeda K, Iguchi A, Sasahara Y, Takada H, et al.
  • Organizer: 46th European Society for Blood and Marrow Transplantation
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Congenital biliary dilatation in an infant with citrin deficiency. (2020)
  • Author(s): Morita A, Imagawa K, Tagawa M, Takada H
  • Organizer: The 6th World Congress of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition
  • Int'l Joint Research
• [Book] 小児感染免疫学 (2020)
  • Author(s): 高田英俊
  • Total Pages: 780
  • Publisher: 朝倉書店