Integrated study aiming at development of precision medicine for poor prognostic acute lymphoblastic leukemia

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19H03615
• Research Institution: University of Yamanashi
• Principal Investigator: 犬飼 岳史 山梨大学, 大学院総合研究部, 教授 (30293450)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 原間 大輔 山梨大学, 大学院総合研究部, 医学研究員 (10774078) ; 渡邊 敦 山梨大学, 大学院総合研究部, 特任助教 (30610498) ; 大城 浩子 山梨大学, 大学院総合研究部, 医学研究員 (50377537) ; 合井 久美子 山梨大学, 大学院総合研究部, 講師 (70324192) ; 赤羽 弘資 山梨大学, 大学院総合研究部, 助教 (90377531)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 急性リンパ性白血病 / 難治性 / 薬剤感受性 / ゲノム編集 / 個別化治療

Outline of Annual Research Achievements

難治性の急性リンパ性白血病症例において根治を得るには、個別化した治療法の確立が急務である。本研究は、難治性の白血病症例から樹立された多数の細胞株を活用して、薬剤感受性と関連するゲノム情報を同定する新たな取り組みである。すでに各株の多様な化学療法剤・低分子化合物・細胞傷害因子の感受性とゲノム情報をデータベース化し、薬剤感受性モデルとしての有用性を既知の遺伝子との関連から成果をあげている。2020年度には、4編の英文論文を本研究の成果として発表し、5編の英文論文が本研究から派生した成果として発表されている。
小児のALLにおける化学療法の治療成績は、成人領域のさまざまな腫瘍性疾患の治療成績に比べて極めて良好であり、多くの知見が蓄積されてきている。そこで本研究では、われわれが小児白血病の薬剤感受性で明らかにしてきた研究成果を、成人のがん領域に応用することも目指すべき新たな方向として取り組んでいる。また、bisulfate PCRによる遺伝子のメチル化状態の評価をHPLC法で計測する系を、脳神経外科および臨床病理部と連携して成人の悪性膠芽腫のMGMT遺伝子におけるメチル化状態の評価へ応用し、実用化に成功して特許を取得するとともに、成果を論文報告した。
このように、本研究では国内外の多様なバック・グラウンドを持つ研究者との連携を深めて、網羅的および探索的な解析を中心に展開し、ゲノム編集技術も駆使した高いエビデンス・レベルの情報を蓄積させて、難治性白血病における個別化治療と、成人がんへの応用を可能とするイノベーションを創出する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

BCP-ALL株を対象に、ASNS遺伝子の高メチル化状態がアスパラギナーゼ感受性に直接に寄与し、臨床検体でも予後良好な染色体異常を持つ症例において、高頻度で高メチル化状態にあることを報告した（Blood）。T-ALLにおいても同様の解析を進めて、SPI1-fusion陽性症例では基本的にASNS遺伝子が非メチル化状態にあって、予後不良の一因であることを明らかにした(in revision)。
維持療法のkey drugである6MP感受性においては、薬物動態を模した条件で解析を進めて、NUDT15遺伝子の多型とNT5C2およびPRPS1遺伝子の変異が独立して影響することを明らかにした(in revision)。
一方、ステロイド受容体(NR3C1)遺伝子の変異を次世代シーケンサーで解析したところ、特に再発時に樹立された細胞株において高率に変異が検出された。また、変異陽性の細胞株はいずれもステロイド剤に耐性を示した。変異の獲得がステロイド剤に耐性をもたらすことを内因性の遺伝子発現で検証した研究は初めてであり、論文を投稿準備中である。
近年は、CAR-T細胞やBlinatumomabによる免疫療法が、難治性のBCP-ALLに対して有効であることが明らかになっている。これらの細胞傷害性T細胞(CTL)を用いた治療では、CTL上に発現されている細胞傷害因子のTRAILが、白血病細胞上に発現されているdeath receptorであるDR4およびDR5との結合を介して白血病細胞に細胞死を誘導する。そこで、BCP-ALLにおけるTRAIL感受性とDR4/DR5遺伝子のメチル化状態との関連性を解析した。その結果、細胞株ではDR4/DR5遺伝子のメチル化がTRAIL耐性に寄与している一方で、多くの臨床検体では非メチル化状態にあることを明らかにした(in revision)。

Strategy for Future Research Activity

ここまでの研究成果から、ASNS遺伝子が高メチル化状態にある腫瘍であれば、白血病でなくてもアスパラギナーゼが化学良材として有効である可能性が示唆される。そこで、成人がんを含むデータベースを解析したところ、一部の症例でASNS遺伝子が高メチル化状態にある固形がんを見出した。そこで、本研究では治療薬としてアスパラギナーゼの有効性を検証中である。
CRISPR/Cas9を用いるゲノム編集技術を応用した、相同組み替えによる標的遺伝子への変異の導入では一定の成果を収めているが、これまでのところ組み替え可能な細胞株が限られている点が課題であった。そこで、新たに開発された「プライム編集」や「塩基編集」などの応用技術の有用性を検証中である。また、薬剤感受性に寄与する遺伝子をCRISPR/Cas9でノック・アウトさせたゼブラフィッシュの系を樹立し、現在その薬剤感受性を評価している。今後は、そのゼブラフィッシュに、ヒトの野生型および変異型の遺伝子を導入することで、ヒトのモデル実験系を樹立する計画である。
本研究では、これまでに構築してきたGWASやCRISPR screeningなどでリスト・アップされてきた薬剤感受性遺伝子の候補の中で、より臨床的な意義の高い遺伝子を、いかにして選別するかが研究の大きな課題であった。近年、急速に整備されてきたALL臨床検体の公開データベースを活用することで、臨床的な意義をある程度評価することが可能になってきている。こうした流れで候補遺伝子を絞り込み、最終的にはゲノム編集技術によって検証することで「真の」薬剤感受性遺伝子を同定し、将来的な個別化治療への道を拓くことを目指す。

Research Products

• [Int'l Joint Research] St Jude Children’s Research Hospital(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: St Jude Children’s Research Hospital
• [Int'l Joint Research] Georg-Speyer-Haus and Goethe University(ドイツ)
  • Country Name: GERMANY
  • Counterpart Institution: Georg-Speyer-Haus and Goethe University
• [Int'l Joint Research] Wellcome Sanger Institute(英国)
  • Country Name: UNITED KINGDOM
  • Counterpart Institution: Wellcome Sanger Institute
• [Int'l Joint Research] Karolinska University Hospital/Uppsala University(スウェーデン)
  • Country Name: SWEDEN
  • Counterpart Institution: Karolinska University Hospital/Uppsala University
• [Int'l Joint Research] Cancer Science Institute of Singapore(シンガポール)
  • Country Name: SINGAPORE
  • Counterpart Institution: Cancer Science Institute of Singapore
• [Journal Article] Landscape of driver mutations and their clinical impacts in pediatric B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia (2020)
  • Author(s): Ueno H, Yoshida K, Shiozawa Y, Nannya Y, Iijima-Yamashita Y, Kiyokawa N, Shiraishi Y, Chiba K, Tanaka H, Isobe T, Seki M, Kimura S, Makishima H, Nakagawa MM, Kakiuchi N, Kataoka K, Yoshizato T, Nishijima D, Deguchi T, Ohki K, Sato A, Takahashi H, Hashii Y, Tokimasa S, Hara J, Kosaka Y, Kato K, Inukai T, et al.
  • Journal Title: Blood Advances Volume: 4 Pages: 5165～5173
  • DOI: 10.1182/bloodadvances.2019001307
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Specific, targetable interactions with the microenvironment influence imatinib-resistant chronic myeloid leukemia. (2020)
  • Author(s): Kumar R, Pereira RS, Zanetti C, Minciacchi VR, Merten M, Meister M, Niemann J, Dietz MS, Russel N, Schnutgen F, Tamai M, Akahane K, Inukai T, Oellerich T, Kvasnicka HM, Pfeifer H, Nicolini FE, Heilemann M, Van Etten RA, Krause DS.
  • Journal Title: Leukemia Volume: 34 Pages: 2087-2101
  • DOI: 10.1038/s41375-020-0866-1
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Impact of immunophenotypic characteristics on genetic subgrouping in childhood acute lymphoblastic leukemia: Tokyo Children's Cancer Study Group (TCCSG) study L04-16. (2020)
  • Author(s): Ohki K, Takahashi H, Fukushima T, Nanmoku T, Kusano S, Mori M, Nakazawa Y, Yuza Y, Migita M, Okuno H, Morimoto A, Yoshino H, Kato M, Hayashi Y, Manabe A, Ohara A, Hasegawa D, Inukai T, Tomizawa D, Koh K, Kiyokawa N; Tokyo Children's Cancer Study Group (TCCSG).
  • Journal Title: Genes Chromosomes Cancer Volume: 59 Pages: 551-561
  • DOI: 10.1002/gcc.22858
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Association of relapse-linked ARID5B single nucleotide polymorphisms with drug resistance in B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cell lines. (2020)
  • Author(s): Tamai M, Huang M, Kagami K, Abe M, Somazu S, Shinohara T, Harama D, Watanabe A, Akahane K, Goi K, Sugita K, Goto H, Minegishi M, Iwamoto S, Inukai T.
  • Journal Title: Cancer Cell Int Volume: 20 Pages: 434
  • DOI: 10.1186/s12935-020-01524-0
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Inherited genetic variants associated with glucocorticoid sensitivity in leukaemia cells. (2020)
  • Author(s): Shinohara T, Urayama KY, Watanabe A, Akahane K, Goi K, Huang M, Kagami K, Abe M, Sugita K, Okada Y, Goto H, Minegishi M, Iwamoto S, Inukai T.
  • Journal Title: J Cell Mol Med Volume: 24 Pages: 12920-12932
  • DOI: 10.1111/jcmm.15882
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Association of aberrant ASNS imprinting with asparaginase sensitivity and chromosomal abnormality in childhood BCP-ALL. (2020)
  • Author(s): Watanabe A, Miyake K, Nordlund J, Syvunen AC, van der Weyden L, Honda H, Yamasaki N, Nagamachi A, Inaba T, Ikawa T, Urayama KY, Kiyokawa N, Ohara A, Kimura S, Kubota Y, Takita J, Goto H, Sakaguchi K, Minegishi M, Iwamoto S, Shinohara T, Kagami K, Abe M, Akahane K, Goi K, Sugita K, Inukai T.
  • Journal Title: Blood Volume: 136 Pages: 2319-2333
  • DOI: 10.1182/blood.2019004090
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] High prevalence of MEF2D fusion in human B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cell lines. (2020)
  • Author(s): Akahane K, Yasuda T, Tsuzuki S, Hayakawa F, Kiyokawa N, Somazu S, Watanabe A, Kagami K, Abe M, Harama D, Goi K, Kawazu M, Kojima S, Imamura T, Goto H, Iwamoto S, Minegishi M, Abe M, Hojo H, Inaba T, Mano H, Sugita K, Inukai T.
  • Journal Title: Hematol Oncol Volume: 38 Pages: 614-617
  • DOI: 10.1002/hon.2762
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Aurora B kinase as a therapeutic target in acute lymphoblastic leukemia. (2020)
  • Author(s): Goto H, Yoshino Y, Ito M, Nagai J, Kumamoto T, Inukai T, Sakurai Y, Miyagawa N, Keino D, Yokosuka T, Iwasaki F, Hamanoue S, Shiomi M, Goto S.
  • Journal Title: Cancer Chemother Pharmacol Volume: 85 Pages: 773-783
  • DOI: 10.1007/s00280-020-04045-9
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Assessment of MGMT methylation status using high-performance liquid chromatography in newly diagnosed glioblastoma. (2020)
  • Author(s): Hanihara M, Miyake K, Watanabe A, Yamada Y, Oishi N, Kawataki T, Inukai T, Kondo T, Kinouchi H.
  • Journal Title: Clin Epigenetics Volume: 12 Pages: 174
  • DOI: 10.1186/s13148-020-00968-5
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Molecular mechanisms for drug-resistance of poor-prognostic and relapsed acute lymphoblastic leukemia (2020)
  • Author(s): Takeshi Inukai
  • Organizer: 第82回日本血液学会学術集会
  • Invited
• [Book] ゲノム編集技術を応用した製品開発とその実用化 第5章8節「ゲノム編集技術を用いた薬剤耐性をもつ白血病細胞株の樹立と医薬品評価への応用」ゲノム編集技術を応用した製品開発とその実用化 第5章8節 (2021)
  • Author(s): 玉井望雅, 犬飼岳史
  • Total Pages: 12
  • Publisher: 技術情報協会
  • ISBN: 9784861048272
• [Remarks] 山梨大学小児科ホームページ
  • URL: https://yuhp-ped.jp
• [Remarks] 急性リンパ性白血病に対する治療薬のゲノム薬理学的な効果を解明 ―個別化治療への道を拓く成果
  • URL: https://www.yamanashi.ac.jp/wp-content/uploads/2021/02/20210222press.pdf