iPS発がんモデルとゲノム編集スクリーニングによる神経芽腫エピゲノム療法開発

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19H03625
• Research Institution: Research Institute for Clinical Oncology, Saitama Cancer Center
• Principal Investigator: 上條 岳彦 埼玉県立がんセンター(臨床腫瘍研究所), 臨床腫瘍研究所, 所長 (90262708)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大平 美紀 埼玉県立がんセンター(臨床腫瘍研究所), 臨床腫瘍研究所, 研究員 (20311384) ; 堺 隆一 北里大学, 医学部, 教授 (40215603) ; 牛島 俊和 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 分野長 (90232818)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: iPS / NCC / neuroblastoma / transcriptome / ChIPseq / MYCN / polycomb

Outline of Annual Research Achievements

I-1.神経芽腫におけるヒストン修飾コードのChIPseq解析とメチローム解析
神経芽腫細胞株を用いて、ChIPseq解析：MYCN, H3K4me3, H3K27AceをMACS2ソフトウェアで解析した。TSS周囲10kbのヒートマップ解析で、これらの３つの結合部位は高頻度に一致していることを明らかにした。H3K4me3結合の13000部位の約6割7000遺伝子にMYCN結合が認められ、神経芽腫においてMYCNが転写のマスターレギュレーターであることを示唆していた。この7000遺伝子の関与する経路をDAVIDソフトウェアを用いて解析すると、転写、翻訳、細胞周期に関る経路の存在が認められた。次に神経芽腫細胞株を用いて、ChIPseq解析：H3K27me3とポリコームPRC2のEZH2を行った。このピークコールはDANPOS2ソフトウェアを用いて行い、閾値設定をlog10q value>50にて解析した。結果はH3K27me3とポリコームPRC2のEZH2で共在遺伝子が高頻度に認められた。同NB細胞にてイルミナInfiniumアレイを用いたメチローム解析を行った。PRC2分子EZH2の低分子阻害剤EPZ-6437を用いたところ、ゲノムメチル化に与える影響は少ないことが判明した。さらにDNMT阻害剤をEZH2iと併用すると、相乗的な細胞増殖抑制効果が認められた。
I-2. MYCN導入NCC形質転換クローンのトランスクリプトーム解析
アジレントマイクロアレイによるトランスクリプトーム解析を野生型iPS:3例とp53変異患者由来iPS1例について行った。また同じく野生型iPSから誘導したNCC:3例とp53変異患者由来iPSから誘導したNCC1例のトランスクリプトーム解析を行った。さらに、これらを免疫不全マウスの副腎周囲脂肪織に移植し、得られた腫瘍のトランスクリプトーム解析を行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

I.神経芽腫発がんにかかわるゲノム・エピゲノム変化と発現変化のオミックス解析;担当：上條、大平、杉野、迎、竹信、堺、牛島）については大平、杉野、上條がトランスクリプトームとChIPseq解析、堺らがALK等の神経芽腫Oncogeneのプロテオーム解析、牛島らがメチローム解析をそれぞれ予定に沿って行った。
I-2. MYCN導入NCC形質転換クローンのトランスクリプトーム解析
迎、上條がiPS培養及びNCC分化・形質転換を行い、形質転換及び移植腫瘍を順調に作出した。これらのトランスクリプトーム解析をアジレントアレイで行った。
II.EZH阻害剤による神経芽腫エピゲノム療法開発とゲノム編集スクリーニングによる改良
竹信、上條らがマルチオミックス解析により、EZH2i耐性の分子機構を明らかにしつつある。本実験は現在論文作成中であり、EZH2i耐性をDNMTiの併用がキャンセルし、その機構にがん抑制遺伝群の脱抑制、MYCNによる神経芽腫増殖制御ループの抑制があることを見出した。

Strategy for Future Research Activity

I-1.神経芽腫におけるヒストン修飾コードのChIPseq解析とメチローム解析およびI-2. MYCN導入NCC形質転換クローンのトランスクリプトーム解析
これらのChIPseq解析を基に、MYCN導入NCC形質転換クローンのChIPseq解析を行っている。また、神経芽腫PDXサンプルを2種保有しており、これらにおいてもChIPseq解析を施行し、神経芽腫におけるエピゲノム変異に関るヒストンコードを解明していく。更に、DNMTiとEZH2iとの併用による相乗的な細胞増殖抑制効果の分子機構をトランスクリプトーム、ChIPseq,メチロームのmulti-omics解析をインフォマティックスを用いて明らかにしていく。また今回のMYCN, H3K4me3, H3K27Ace ChIPseq解析から複数のMYCN増幅NB細胞でMYCNによって転写制御されるCore MYCN target遺伝子群を見出し、これを制御している分子機構を解析していく。現在得られている結果を他グループのChIPseq結果と統合解析し、さらにトランスクリプトーム結果と統合して、より普遍的な重要治験をインフォマティックスを用いて同定する。
II.EZH阻害剤による神経芽腫エピゲノム療法開発とゲノム編集スクリーニングによる改良
ショットガンプロテオミクスを用いたEZH結合分子群およびクロマチン結合分子群リストの作成とそのゲノム編集スクリーニングによるEZH阻害剤の協調的標的分子同定を行う。

Research Products

• [Journal Article] Recycling endosomal CD133 functions as an inhibitor of autophagy at the pericentrosomal region (2019)
  • Author(s): Izumi Hideki、Li Yuanyuan、Shibaki Masami、Mori Daisuke、Yasunami Michio、Sato Seiji、Matsunaga Hisashi、Mae Takao、Kodama Kenji、Kamijo Takehiko、Kaneko Yasuhiko、Nakagawara Akira
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 9 Pages: 1-17
  • DOI: 10.1038/s41598-019-39229-8
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] A Polymorphic Variant in p19Arf Confers Resistance to Chemically Induced Skin Tumors by Activating the p53 Pathway (2019)
  • Author(s): Saito Megumi、Okumura Kazuhiro、Isogai Eriko、Araki Kimi、Tanikawa Chizu、Matsuda Koichi、Kamijo Takehiko、Kominami Ryo、Wakabayashi Yuichi
  • Journal Title: Journal of Investigative Dermatology Volume: 139 Pages: 1459～1469
  • DOI: 10.1016/j.jid.2018.12.027
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Combined Genetic and Chromosomal Characterization of Wilms Tumors Identifies Chromosome 12 Gain as a Potential New Marker Predicting a Favorable Outcome (2019)
  • Author(s): Haruta Masayuki、Arai Yasuhito、Okita Hajime、Tanaka Yukichi、Takimoto Tetsuya、Sugino Ryuichi P.、Yamada Yasuhiro、Kamijo Takehiko、Oue Takaharu、Fukuzawa Masahiro、Koshinaga Tsugumichi、Kaneko Yasuhiko
  • Journal Title: Neoplasia Volume: 21 Pages: 117～131
  • DOI: 10.1016/j.neo.2018.10.007
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Results of a prospective clinical trial JN‐L‐10 using image‐defined risk factors to inform surgical decisions for children with low‐risk neuroblastoma disease: A report from the Japan Children's Cancer Group Neuroblastoma Committee (2019)
  • Author(s): Iehara Tomoko、Yoneda Akihiro、Yokota Isao、Takahashi Hideto、Teramukai Satoshi、Kamijyo Takehiko、Nakazawa Atsuko、Takimoto Tetsuya、Kikuta Atsushi、Yagyu Shigeki、Ikeda Hitoshi、Nakagawara Akira、Tajiri Tatsuro、Japan Childhood Cancer Group Neuroblastoma Committee (JNBSG)
  • Journal Title: Pediatric Blood & Cancer Volume: 66 Pages: 1-7
  • DOI: 10.1002/pbc.27914
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] THE EVALUATION OF THE NEW GUIDELINE FOR ASSESSING IMAGE-DEFINED RISK FACTORS IN THE LOW-RISK PROTOCOL (JN-L-10) FROM THE JAPAN CHILDREN’S CANCER GROUP NEUROBLASTOMA COMMITTEE (2019)
  • Author(s): Yoneda A , Iehara T, Yokota I, Takahashi H , Teramukai S, Kamijo T, Nakazawa A Takimoto T, Kikuta A, Ikeda H, Nakagawara A , Tajiri T, Japan Children’s Cancer Group (JCCG) Neuroblastoma Committee (JNBSG),
  • Organizer: SIOP Lyon Convention Centre, Lyon, France
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Genomic characterization of high-risk neuroblastoma by cancer panels. (2019)
  • Author(s): Miki Ohira, Hiroyuki Shichino, Takashi Kubo, Masayuki Haruta, Tetsuya Takimoto, Atsuko Nakazawa, Hiroki Nagase, Tatsuro Tajiri, Akira Nakagawara, Hitoshi Ichikawa, Tomoro Hishiki, Takehiko Kamijo
  • Organizer: 第78回日本癌学会学術総会2019.9.26-28 京都
• [Presentation] Development of neuroblastoma model from iPSC-based neural crest cell. (2019)
  • Author(s): K Mukae, H Takenobu, R Sugino, M Ohira, S Satoh, Y Endo, R Okada, Mi Haruta, J Toguchida, K Osafune, T Nakahata, Takehiko Kamijo
  • Organizer: 第78回日本癌学会学術総会2019.9.26-28 京都
• [Presentation] Patterns of the first- and second-hit WT1 mutations may affect the risk of developing Wilms tumor in syndromic patients (2019)
  • Author(s): KanekoY, Haruta M, Kamijo T, et al.,
  • Organizer: 第78回日本癌学会学術総会2019.9.26-28 京都
• [Presentation] Miki Ohira, Hiroyuki Shichino, Takashi Kubo, Masayuki Haruta, Tetsuya Takimoto, Atsuko Nakazawa, Fumito Yamazaki, Hiroki Nagase, Tatsuro Tajiri, Akira Nakagawara , Hitoshi Ichikawa, Tomoro Hishiki, Takehiko Kamijo, Japan Children’s Cancer Group (JCCG) Neuroblastoma Committee (JNBSG), (2019)
  • Author(s): Toward genome medicine for pediatric cancer: Genomic characterization of high-risk neuroblastoma by cancer gene panel tests.
  • Organizer: JSPHO2019, Hiroshima, Japan