2020 Fiscal Year Annual Research Report
Stage-specific roles of Notch signaling on induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells
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19H03692
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| Research Institution | Tokai University |
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Principal Investigator |
細川 裕之 東海大学, 医学部, 特任講師 (60431756)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | T細胞 / Notchシグナル / 転写因子 / 造血幹細胞 / 遺伝子発現制御 / 系列決定 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
造血幹細胞からTリンパ球への分化には、胸腺微小環境からのNotchシグナルが必須である。胸腺移入直後の 初期ProT細胞において、Notchシグナルは転写因子Tcf7やGATA3、Bcl11bの発現を誘導することで、T前駆細胞の持つB細胞や自然リンパ球やミエロイド系列への分化能を排除し、T細胞への運命を決定づける。T細胞への運命決定がなされた後期ProT細胞では、Rag1やRag2といったT細胞受容体の遺伝子再構成に関わる遺伝子群の発現がNotchシグナル依存的に誘導される。しかし、初期ProT細胞でNotch依存的にコントロールされていたTcf7やGATA3、Bcl11bはNotchシグナル非依存的に発現が維持される。そこで、本研究では、Notchシグナルがどのように発生段階特異的な機能を発揮するのか、T細胞初期分化をモデルとし、その分子メカニズムを明らかにする事を目的とする。
今年度はCrispr/Cas9システムによりステージ特異的なNotchノックアウトProT細胞のRNA-seq解析を行い、多くの発生段階特異的なNotchターゲット遺伝子を同定した。さらに、初期ProT細胞と後期ProT細胞を用いてNotch-ICと転写因子複合体を形成するRBPJのChIP-seq解析を行い、Notch転写因子複合体が結合するゲノム領域がProT細胞の発生段階によってダイナミックに変化する事を明らかにした。これらのデータを統合的に解析し、Notchシグナルがステージ特異的なターゲット遺伝子の発現を制御する事で、T細胞の初期発生に必須の役割を担っていることを責任著者として論文報告した (J Cell Biol, 2020)。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は、発生段階特異的なNotchターゲット遺伝子とNotch転写因子複合体の結合ゲノム領域の網羅的同定を行い、論文発表を行った。さらに、これまで初代培養株では困難であったNotch ICのクロマチン免疫沈降解析について、２つのモノクローナル抗体を混ぜて使用することで、実験系の確立に成功した。今年度は、Notch-ICのChIP-seqを行い、初期ProT細胞と後期ProT細胞における、Notch-IC会合ゲノム領域を網羅的に同定した。
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| Strategy for Future Research Activity |
(A), 発生段階特異的にNotch1-ICに結合する分子群のプロテオミクス解析；Notchシグナルが発生段階特異的にターゲット遺伝子を制御するメカニズムとして、ステージ特異的な転写因子と会合している可能性が考えられる。そこで、Notch1-ICにMycおよびFlagタグを付加したレトロウイルス発現ベクターを作製し、Notch1-IC 会合分子のプロテオミクス解析を行う。昨年度DN3細胞株を用いてNotch複合体の網羅的同定に成功した。来年度はは初代培養細胞を用いて、DN1/2a細胞、DN3細胞を用いてステージ特異的なNotch複合体構成分子の網羅的同定を目指す。
(B), ステージ特異的にNotch1-ICの結合している遺伝子領域の同定；Notch-ICやRbpjに対するクロマチン免疫沈降 (ChIP)解析は抗体のqualityが原因で困難であったが、我々は細胞のクロスリンクの条件と、複数のモノクローナル抗体を混ぜて使用することで、ProT細胞におけるRbpjのChIPシークエンス解析を行うことに成功した。昨年度は、Notch-ICに対するChIP解析法の確立に成功した。本年度はduplicate以上でNotch-ICのChIP-seq解析を行い、reproducibleなNotch-IC会合領域を同定する。
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