Attempt of segmentation of positive / negative factor and absolute evaluation of intra-tumor immunity

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19H03729
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 和田 尚 大阪大学, 医学系研究科, 特任教授(常勤) (70243459)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐藤 永一 東京医科大学, 医学部, 准教授 (60408101) ; 垣見 和宏 東京大学, 医学部附属病院, 特任教授 (80273358) ; 牧野 知紀 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (80528620) ; 岩堀 幸太 大阪大学, 医学系研究科, 特任講師(常勤) (80566448) ; 森本 晶子 大阪大学, 医学系研究科, 特任助教(常勤) (60601193) [Withdrawn]
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 効果T細胞 / 免疫抑制因子 / MDSC / TAM / Treg / ImmunoGram / ImmunoScore

Outline of Annual Research Achievements

腫瘍組織内免疫担当細胞・因子を、効果細胞側と免疫抑制側に大別し、さらに主にフローサイトメトリーを用いて分画化、分画ごとの多彩な機能を解析し、絶対的な強度を付与した各分画を集合させることで、最終的にがん種ごと、症例ごとのがん免疫の強さを総合的に絶対的に評価することを目的としている。
個人間・がん種間の絶対的評価に向けて、消化器癌、呼吸器癌、婦人科癌の症例・新鮮腫瘍組織を新たに集積し、すでに集積済みの検体なども使用可能にするための環境整備を行った。①T細胞を中心とした効果細胞とCD3、CD14、CD15陽性細胞中の抑制因子フローサイトメーター解析、②さらなる亜分画化への工夫としての次世代シーケンサーの応用、③各分画の抗原発現による機能解析、④各分画の更なる機能解析のための培養系の応用；抗原刺激による効果細胞誘導能、刺激培養によるサイトカイン・細胞傷害因子などの産生、遺伝子導入標的細胞に対する直接細胞傷害能、効果細胞との共培養による抑制機能測定、⑤東京大学・垣見教授による遺伝子的解析および東京医大・佐藤准教授による免疫組織学的解析による裏付け、⑥大阪大学・牧野先生による臨床データとの比較、を実施する。
多くの症例ごと、そしてがん種ごとに解析していく事で、絶対的な評価を行うため、個々の解析方法を適応していく。それらに先駆けて、絶対的評価の検討のため、PD-1経路阻害薬などの免疫療法を受けた治験症例においてこれら解析を実施し、その臨床効果と対比しうる包括的腫瘍免疫能評価方法を確定する。Nivolumab投与症例及び抗CCR4抗体投与治験症例の末梢血及び腫瘍組織内免疫細胞を用いた上記包括的解析を進めている。ただし、総合的免疫状態の同定のための評価の確立には更なる症例の集積が必要となる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

新鮮腫瘍検体として、食道・胃・大腸癌を43症例、胸腺腫・肺癌を22症例、卵巣癌21症例を集積し、新鮮検体よりCD3、CD14、CD15陽性細胞を抽出後、抗原発現をFACS解析したのちに、保存した。新規症例数は順調に蓄積している。
一方で、保存されている抗CCR4抗体投与治験参加症例の腫瘍組織内浸潤免疫担当細胞を用い、FACSによる抗原発現解析、腫瘍組織mRNAによる次世代シーケンサーを用いたTCRレパトア解析、CyberSort解析、固定組織による免疫組織学的解析を実施し、FACS／遺伝子／免疫組織化学の3手法による結果の整合性を検討、さらには臨床効果との比較を実施しようとしている。
効果細胞の機能解析では、①無刺激での産生頻度、CD3/28あるいはPMA/ionomycin刺激によるIFNgをはじめとする各種サイトカイン産生能、②細胞傷害能としてのパーフォリン/グランザイム産生能、③実際の細胞傷害能を抗原非特異的に測定するためのBiTE並びにCD3抗体発現標的細胞に対する反応、についてデータを集積している。特に細胞傷害能に関しては、種々の方法に統一性が存在するのかを確認するため、④CMVやMelanAなどの腫瘍抗原に対する反応性T細胞誘導能を観察する予定である。
一方、免疫抑制細胞の機能解析では、健常人末梢血を用いた上記④の誘導において、混合培養することで誘導能がいかに抑制されるかを解析する。特にTregではその働きがよく検索されていることから、抑制性の対照研究として実施している。新規活性化TregマーカーとしてのCCR8やCD25、Foxp3、そしてそのほかの抑制細胞であるCD14、CD15陽性細胞の亜分画を用い、その抑制能を症例ごとに詳細に解析している。
これら成果は下記のように多数の論文報告として表れている。

Strategy for Future Research Activity

さらに検体採取を行い、①各種免疫担当細胞の頻度・細胞数（腫瘍重量当たり）、②各種免疫担当細胞分画におけるPD-1、Tim-3、Ki67、PD-L1などのチェックポイント分子を中心とした各種抗原発現、③T細胞の機能不全としての疲弊マーカーとしてTOX発現、④効果細胞としてのNK細胞、innate lymphoid cell (ILC)サブセットの頻度、そして機能解析として⑤IFNg産生頻度（無刺激にて）、⑥CD3/28抗体刺激あるいはPMA/ionomycin刺激による分裂能・各種サイトカイン産生能・パーフォリン/グランザイム産生能、⑦CMVやMART-1・NY-ESO-1抗原ペプチドなどを用いた抗原特異的反応性細胞誘導能の測定、⑧BiTEあるいは抗CD3抗体遺伝子導入した標的細胞に対する細胞傷害能、を計測する。一方、免疫抑制細胞側では、①CD25、CD14、CD15陽性細胞群、②M-MDSC、G-MDSC、TAM、活性化Tregなど既知の抑制細胞同定のため、CD11b、HLA-DR、CD33、CD206、CD25、Foxp3、ICOS、CTLA-4抗体などを用い、その亜分画頻度解析、③抑制能を評価するために、T細胞機能アッセイ系に付加培養を行う、④特にCD15陽性細胞群の亜分画化ではファージ抗体ライブラリー法、シングルセルRNAシークエンス法を用いる。
消化器外科・牧野より食道・胃・大腸癌を、呼吸器内科・岩堀より胸腺腫・肺癌を、産婦人科より卵巣癌とし情報を集積する。現在実施中の医師主導免疫療法治験症例の試料を用い、その臨床効果などと対比させる。
東京大学・垣見により遺伝子学的にImmunoGram、CyberSortなどを用い解析、また東京医科大学・佐藤により組織学的に種々の腫瘍組織内浸潤免疫担当細胞の頻度を解析し、我々の得られる結果との整合性を図る。

Research Products

• [Journal Article] PD-1+ Tim3+ tumor-infiltrating CD8 T cells sustain the potential for IFN-γ production, but lose cytotoxic activity in ovarian cancer (2020)
  • Author(s): Sawada Masaaki、Goto Kumiko、Morimoto-Okazawa Akiko、Haruna Miya、Yamamoto Kei、Yamamoto Yoko、Nakagawa Satoshi、Hiramatsu Kosuke、Matsuzaki Shinya、Kobayashi Eiji、Kawashima Atsunari、Hirata Michinari、Iwahori Kota、Kimura Toshihiro、Ueda Yutaka、Kimura Tadashi、Wada Hisashi
  • Journal Title: International Immunology Volume: 32 Pages: 397～405
  • DOI: 10.1093/intimm/dxaa010
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Tumour grade significantly correlates with total dysfunction of tumour tissue-infiltrating lymphocytes in renal cell carcinoma (2020)
  • Author(s): Kawashima A、Kanazawa T、Kidani Y、Yoshida T、Hirata M、Nishida K、Nojima S、Yamamoto Y、Kato T、Hatano K、Ujike T、Nagahara A、Fujita K、Morimoto-Okazawa A、Iwahori K、Uemura M、Imamura R、Ohkura N、Morii E、Sakaguchi S、Wada H、Nonomura N
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 10 Pages: 6220
  • DOI: 10.1038/s41598-020-63060-1
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Docetaxel Upregulates HMGB1 Levels in Non-small Cell Lung Cancer (2020)
  • Author(s): Haruna Miya、Hirata Michinari、Iwahori Kota、Kanazawa Takayuki、Yamamoto Yoko、Goto Kumiko、Kawashima Atsunari、Morimoto-Okazawa Akiko、Funaki Soichiro、Shintani Yasushi、Kumanogoh Atsushi、Wada Hisashi
  • Journal Title: Biological and Pharmaceutical Bulletin Volume: 43 Pages: 399～403
  • DOI: 10.1248/bpb.b19-00702
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Tumor‐infiltrating M2 macrophage in pretreatment biopsy sample predicts response to chemotherapy and survival in esophageal cancer (2020)
  • Author(s): Yamamoto Kei、Makino Tomoki、Sato Eiichi、Noma Toshiki、Urakawa Shinya、Takeoka Tomohira、Yamashita Kotaro、Saito Takuro、Tanaka Koji、Takahashi Tsuyoshi、Kurokawa Yukinori、Yamasaki Makoto、Nakajima Kiyokazu、Mori Masaki、Doki Yuichiro、Wada Hisashi
  • Journal Title: Cancer Science Volume: 111 Pages: 1103～1112
  • DOI: 10.1111/cas.14328
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Immunotherapeutic potential of CD4 and CD8 single-positive T cells in thymic epithelial tumors (2020)
  • Author(s): Yoko Yamamoto, Kota Iwahori, Soichiro Funaki, Mitsunobu Matsumoto, Michinari Hirata, Tetsuya Yoshida, Ryu Kanzaki, Takashi Kanou, Naoko Ose, Masato Minami, Eiichi Sato, Atsushi Kumanogoh, Yasushi Shintani, Meinoshin Okumura, Hisashi Wada
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 10 Pages: 4064
  • DOI: 10.1038/s41598-020-61053-8
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Clinical importance of the expression of CD4+CD8+ T cells in Renal Cell Carcinoma. (2020)
  • Author(s): Nishida K, Kawashima A, Kanazawa T, Kidani Y, Yoshida T, Hirata M, Yamamoto K, Yamamoto Y, Sawada M, Kato R, Kato T, Hatano K, Ujike T, Fujita K, Uemura M, Morimoto-Okazawa A, Iwahori K, Yamasaki M, Ohkura N, Sakaguchi S, Nonomura N, Doki Y, Wada H.
  • Journal Title: Int Immunol Volume: Jan24 Pages: -
  • DOI: 10.1093/intimm/dxaa004.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Endogenous CXCL9 affects prognosis by regulating tumor-infiltrating NK cells in intrahepatic cholangiocarcinoma (2020)
  • Author(s): Fukuda Y, Asaoka T, Eguchi H, Yokota Y, Kubo M1, Kinoshita M, Urakawa S, Iwagami Y, Tomimaru Y, Akita H, Noda T, Gotoh K, Kobayashi S, Hirata M, Wada H, Mori M, Doki Y.
  • Journal Title: Cancer Sci. Volume: 111 Pages: 323-333
  • DOI: 10.1111/cas.14267
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Peri-operative monocyte count is a marker of poor prognosis in gastric cancer: increased monocytes are a characteristic of myeloid-derived suppressor cells. (2019)
  • Author(s): Shinya Urakawa, Makoto Yamasaki, Kumiko Goto, Miya Haruna, Michinari Hirata, Akiko Morimoto-Okazawa, Atsunari Kawashima, Kota Iwahori, Tomoki Makino, Yukinori Kurokawa, Tomomi Yamada, Masaki Mori, Yuichiro Doki, Hisashi Wada.
  • Journal Title: Cancer Immunology, Immunotherapy Volume: 68 Pages: 1341-1350
  • DOI: 10.1007/s00262-019-02366-0
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Peripheral T cell cytotoxicity predicts T cell function in the tumor microenvironment. (2019)
  • Author(s): Iwahori K, Shintani Y, Funaki S, Yamamoto Y, Matsumoto M, Yoshida T, Morimoto-Okazawa A, Kawashima A, Sato E, Gottschalk S, Okumura M, Kumanogoh A, Wada H.
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 9 Pages: 2636
  • DOI: 10.1038/s41598-019-39345-5
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Phenotypic Analysis of Tumor Tissue-Infiltrating Lymphocytes in Tumor Microenvironment of Bladder Cancer and Upper Urinary Tract Carcinoma. (2019)
  • Author(s): Kawashima A, Kanazawa T, Jingushi K, Kato T, Ujike T, Nagahara A, Fujita K, Morimoto-Okazawa A, Iwahori K, Uemura M, Imamura R, Wada H, Nonomura N
  • Journal Title: Clin Genitourin Cancer. Volume: 17 Pages: 114-124
  • DOI: 10.1016/j.clgc.2018.11.004
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Serum Antibody Against NY-ESO-1 and XAGE1 Antigens Potentially Predicts Clinical Responses to Anti-Programmed Cell Death-1 Therapy in NSCLC. (2019)
  • Author(s): Ohue Y, Kurose K, Karasaki T, Isobe M, Yamaoka T, Futami J, Irei I, Masuda T, Fukuda M, Kinoshita A, Matsushita H, Shimizu K, Nakata M, Hattori N, Yamaguchi H, Fukuda M, Nozawa R, Kakimi K, Oka M.
  • Journal Title: J Thorac Oncol. Volume: 14 Pages: 2071-2083
  • DOI: 10.1016/j.jtho.2019.08.008
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Reduced Neoantigen Expression Revealed by Longitudinal Multiomics as a Possible Immune Evasion Mechanism in Glioma. (2019)
  • Author(s): Nejo T, Matsushita H, Karasaki T, Nomura M, Saito K, Tanaka S, Takayanagi S, Hana T, Takahashi S, Kitagawa Y, Koike T, Kobayashi Y, Nagae G, Yamamoto S, Ueda H, Tatsuno K, Narita Y, Nagane M, Ueki K, Nishikawa R, Aburatani H, Mukasa A, Saito N, Kakimi K.
  • Journal Title: Cancer Immunol Res. Volume: 7 Pages: 1148-1161
  • DOI: 10.1158/2326-6066.CIR-18-0599
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Severe colitis after PD-1 blockade with nivolumab in advanced melanoma patients: potential role of Th1-dominant immune response in immune-related adverse events: two case reports (2019)
  • Author(s): Yoshino Koji、Nakayama Takayuki、Ito Ayumu、Sato Eiichi、Kitano Shigehisa
  • Journal Title: BMC Cancer Volume: 19 Pages: 1019
  • DOI: 10.1186/s12885-019-6138-7
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Therapeutic potential of PLK1 inhibition in triple-negative breast cancer (2019)
  • Author(s): Ueda Ai、Oikawa Keiki、Fujita Koji、Ishikawa Akio、Sato Eiichi、Ishikawa Takashi、Kuroda Masahiko、Kanekura Kohsuke
  • Journal Title: Laboratory Investigation Volume: 99 Pages: 1275～1286
  • DOI: 10.1038/s41374-019-0247-4
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] PD-1+ regulatory T cells amplified by PD-1 blockade promote hyperprogression of cancer (2019)
  • Author(s): Kamada Takahiro、Togashi Yosuke、Tay Christopher、Ha Danbee、Sasaki Akinori、Nakamura Yoshiaki、Sato Eiichi、Fukuoka Shota、Tada Yasuko、Tanaka Atsushi、Morikawa Hiromasa、Kawazoe Akihito、Kinoshita Takahiro、Shitara Kohei、Sakaguchi Shimon、Nishikawa Hiroyoshi
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 116 Pages: 9999～10008
  • DOI: 10.1073/pnas.1822001116
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Clinical and pathological predictors of recurrence in breast cancer patients achieving pathological complete response to neoadjuvant chemotherapy (2019)
  • Author(s): Asaoka Mariko、Narui Kazutaka、Suganuma Nobuyasu、Chishima Takashi、Yamada Akimitsu、Sugae Sadatoshi、Kawai Saori、Uenaka Natsuki、Teraoka Saeko、Miyahara Kana、Kawate Takahiko、Sato Eichi、Nagao Toshitaka、Matsubara Yuka、Gandhi Shipra、Takabe Kazuaki、Ishikawa Takashi
  • Journal Title: European Journal of Surgical Oncology Volume: 45 Pages: 2289～2294
  • DOI: 10.1016/j.ejso.2019.08.001
  • Peer Reviewed
• [Remarks] 大阪大学医学系研究科・臨床腫瘍免疫学
  • URL: http://www.climm.med.osaka-u.ac.jp/