2020 Fiscal Year Annual Research Report

安全で効率の高い間葉系幹細胞由来エクソソームによる変形性関節症治療法の開発

Research Project

Project/Area Number	19H03781
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	中村憲正大阪大学, 国際医工情報センター, 招へい教授 (50273719)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	落谷孝広東京医科大学, 医学部, 教授 (60192530) 紀ノ岡正博大阪大学, 工学研究科, 教授 (40234314) 弓削類広島大学, 医系科学研究科(保), 教授 (20263676) 下村和範大阪大学, 医学系研究科, 招へい教員 (40755998)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	エクソソーム / 間葉系幹細胞 / 変形性関節症
Outline of Annual Research Achievements	間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell：MSC）は、損傷組織の修復促進効果が知られており、再生医療・細胞治療における優れたソースとして注目を集めているが、MSCが産生するエクソソームを主体とした細胞外小胞（extracellular vesicles：EVs）も、MSC自身と同様の治療効果を示すことが示唆され、MSC由来EVsを用いた新規治療法の可能性も見えてきた。申請者は、変形性関節症に対するMSC由来EVs治療の臨床応用に向けた効率的な治療用EVs調製のための培養条件の確立に向け、本年度は以下の成果を確認できた。 EVsの細胞源は手術時に破棄される脂肪由来MSCとして、同一ドナー由来MSCsを複数の化学的調製培地にて平面培養し、臨床応用を見据えた方法でEVsを回収した。各培地での培養時に得られたEVsサンプルは、エクソソーム含有量や粒子数、タンパク質の組成が大きく異なっていることがわかった。その中で比較的高純度で回収できた方法で得られたEVsを用いて動物実験を行ったところ、変形性膝関節症モデルマウスにEVsを関節腔内投与することで軟骨変性抑制効果が確認できた。また、ビトロ実験においては、軟骨細胞の増殖、遊走能の亢進や炎症を司るマクロファージのタイプを抗炎症へとシフトさせ、臨床応用可能な効率的なEVs回収において基礎となる至適な培養条件を確定させることができた。確立した条件を発展させることで、今後3次元培養と平面培養との比較や、異なる起源のMSCでの比較などが可能になると考えられる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 臨床応用に向けた治療用EVs調製のためには、EVsの規格管理が重要である。一般的には、EVsは粒子数やタンパク質などでその組成を確認するが、限外濾過法などに代表される臨床応用を見据えた方法でEVsを回収すると、培地成分由来の夾雑物も混入する問題点が判明した。サンプル中の夾雑物の混入は、臨床での品質管理を考慮する上で解決すべき重要な問題点であると考えられたが、本年度の成果により、臨床応用を見据えたEVs回収方法において、夾雑物が少なく、かつ変形性膝関節治療に対して十分な治療効果を有するEVsサンプルを回収することが可能となり、目的達成に近づいた。今後、主としてエクソソームが内包するmiRNAについて、次世代シークエンスシステムで網羅的に解析し、機能別分布などの分析を行う予定である。
Strategy for Future Research Activity	臨床応用可能と考えられる効率的なEVs回収において、基礎となる至適な培養条件を確定させることができたので、各培地にてMSCを培養し、それぞれの培地から得られたEVsの機能について詳細に比較する。変形性膝関節治療を考えた際にEVsに期待する効果として、軟骨細胞や滑膜細胞に対する細胞増殖・遊走促進能、抗アポトーシス作用、抗炎症作用の評価を繰り返し行うことで、基礎的データを蓄積する。この際、各サンプル間で投与する粒子数やタンパク質量を揃えることで、その効果の強弱も比較する。また、確立した基礎条件を発展させることで、三次元（TEC化）培養で得られたEVsと平面培養で得られたEVsの内包物の比較検討も行う予定である。以上により得られたデータをもとに論文を執筆する。