2020 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of ABO regulation through topological alteration of chromatin structure
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19H03916
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
小湊 慶彦 群馬大学, 大学院医学系研究科, 教授 (30205512)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
窪 理英子 群馬大学, 医学部, 技術職員 (40747127)
高橋 遥一郎 群馬大学, 大学院医学系研究科, 講師 (50640538)
佐野 利恵 群馬大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (70455955)
早川 輝 群馬大学, 大学院医学系研究科, 助教 (90758575)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ABO遺伝子 / OBP2B遺伝子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまで我々は、ABO遺伝子の転写調節機構を解明してきた。その一つとして、ABO遺伝子イントロン１内に血球細胞特異的エンハンサー（+5.8-kb site）や下流域に上皮細胞特異的エンハンサー(+22.6-kb site)を同定し、+5.8-kb siteが血球細胞におけるABO遺伝子転写活性化に必須であることを実験的また人類遺伝学的手法を用いて明らかにし、+22.6-kb siteが上皮系細胞におけるABO遺伝子転写活性化に必須であることを実験的に明らかにした。近年、クロマチンはトポロジカル関連ドメイン(Topologically Associated Domain, TAD )と呼ばれるループ構造を作り、TADの内部で離れた場所にあるエンハンサーが標的遺伝子に近接し、作用することにより転写調節がなされることが明らかとなった。また、上皮系細胞株であるMCF-7細胞におけるChIA-PET(クロマチン相互作用)データによると、ABO遺伝子とその近隣遺伝子であるOBP2B遺伝子は同一のTAD内に存在する。これを踏まえ、同一のTAD内でABO遺伝子エンハンサーが他の遺伝子発現に関与するとの仮説を立て、それを証明する実験を行い、下記の結果を得ている。さらに、白血病患者においては赤血球表面のABO式血液型抗原の減少が知られており、その原因はABO遺伝子プロモーターのメチル化であるとの報告がある。我々が赤血球表面に血液型抗原減少が認められ骨髄異形成症候群患者2名を調べたところ、転写因子RUNX1変異が血液型抗原減少の原因であった（既発表）。既報と相違するため、今後も検索を続けることとした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CRISPR/Casシステムを用い、胃癌細胞KATOⅢ細胞の+22.6-kb siteを欠失させると、ABO遺伝子だけでなく、遺伝子下流のOBP2B遺伝子の発現低下が認められた。また、KATOⅢ細胞溶解液を用いたウェスタンブロットにおいても+22.6-kb site 欠失によるOBP2Bタンパクの減少を証明した。次に、OBP2B遺伝子上流域を組み込んだルシフェラーゼベクターを作製し、レポーターアッセイを行い、翻訳開始点上流の約300bpの領域がOBP2B遺伝子のプロモーター領域であることを明らかにした。また、OBP2B遺伝子プロモーターを組み込んだレポーターベクターの下流に+22.6-kbsiteを組み込むとOBP2B遺伝子プロモーター活性が上昇した。以上から、OBP2B遺伝子の転写活性化にABO遺伝子エンハンサー+22.6-kb siteが係ることが明らかになった。上皮系細胞株であるMCF-7細胞におけるChIA-PET(クロマチン相互作用)データによると、ABO遺伝子とOBP2B遺伝子は同一のTAD内に存在する。本研究結果からABO遺伝子エンハンサーは、同一のTAD内でOBP2B遺伝子の転写を活性化すると考えられた。OBP2B遺伝子は匂い結合タンパクをコードし、リポカリンファミリーに属する。ヒトOBP2Bタンパクは性腺や乳腺などの分泌腺で高発現するが、ヒトにおける機能は明らかになっていない。TAD内で協調的な遺伝子発現調節がなされるOBP2BタンパクとABO式血液型合成酵素の機能が関連することが考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
赤血球表面に血液型抗原減少が認められ骨髄異形成症候群患者2名では、転写因子RUNX1変異が血液型抗原減少の原因であった（既発表）。白血病患者における血液型抗原減少の原因を検索する。その方法は、１）赤血球表面に血液型抗原減少が認められた白血病患者の末梢血や骨髄細胞からDNAを採取し、ABO遺伝子の解析を行う、２）末梢血や骨髄細胞のDNAについて、bisulfite genomic sequencing によるABO遺伝子プロモーターのメチル化解析を行う、３）末梢血や骨髄細胞のDNAについて、白血病原因遺伝子パネル（QIAGEN QIAseq Targeted DNA Panels）による多数の標的遺伝子の解析を行う、４）認められた変異が体細胞変異に由来するか否かを確認する、５）骨髄細胞に対してセルソーティングを用いた分画を行い、①変異の頻度を調べる、②分画細胞についてABO遺伝子プロモーターのメチル化解析を行う、６）変異の機能解析を行う、①遺伝子に変異を入れた蛋白発現ベクターを準備する、②変異蛋白を発現したレポーターアッセイを行う、③K562細胞に変異蛋白を発現し、内因性ABO遺伝子の変化を測定する、等である。これらの結果を統合し、白血病患者における抗原減少の原因解明を行う。
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[Journal Article] RUNX1 mutation in a patient with myelodysplastic syndrome and decreased erythrocyte expression of blood group A antigen.2020
Author(s)
Hayakawa A, Sano R, Takahashi Y, Kubo R, Harada M, Omata M, Yokohama A, Handa H, Tsukada J, Takeshita H, Tsuneyama H, Ogasawara K, Kominato Y.
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Journal Title
Transfusion
Volume: 60
Pages: 184-196
DOI
Peer Reviewed
