耐性菌パンデミック回避を目指す下水処理システムの最適化

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19H04330
• Research Institution: Kisarazu National College of Technology
• Principal Investigator: 大久保 努 木更津工業高等専門学校, 環境都市工学科, 准教授 (60581519)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 上村 繁樹 木更津工業高等専門学校, 環境都市工学科, 教授 (60300539) ; 井口 晃徳 新潟薬科大学, 応用生命科学部, 准教授 (60599786) ; 安井 宣仁 近畿大学工業高等専門学校, 総合システム工学科 都市環境コース, 准教授 (90547481)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 耐性大腸菌 / 下水処理 / 消毒システム / 耐性遺伝子

Outline of Annual Research Achievements

担体充填層5段で構成された下水処理DHSリアクターより，担体を採取し，保持汚泥1mg当たりの大腸菌数を評価したところ，水試料と同じく流下方向（上段から下段）にかけて大腸菌数の減少傾向が確認された。保持汚泥濃度は流下方向に大きな偏りはなく，8.9-12.8gVS/Lであったことから流下方向に汚泥への吸着，原生動物による捕食，酸素暴露により一定速度で減少したものと考えられた。一方大腸菌数に占める耐性大腸菌の割合は，1剤耐性大腸菌は流下方向で減少するのに対し，2剤と3剤耐性大腸菌は流入下水よりも1段目保持汚泥で4-5倍程度に上昇する傾向が確認された。また，Ampicillin耐性遺伝子 (βラクタマーゼ遺伝子) を標的とするHRP標識プローブを用いたCARD-FISH法の最適化を行い，Ampicillin耐性遺伝子を保有するEscherichia coli細胞の特異的な検出を行うことができた。併せて蛍光活性化セルソーター (FACS)での標的細胞の特異的検出を行った。
不活化実験では，深紫外LEDと低圧紫外線ランプを用い，病原微生物指標である大腸菌phage(QβとMS2)および薬剤耐性菌の不活化評価を行った。紫外線の主波長が異なるため，電力効率当りの不活化率を用い評価を行った結果，深紫外LEDの方が電力供給あたりの不活化効率が大きいことが明らかとなった。薬剤耐性菌の場合は，深紫外LED照射時では低圧紫外線ランプ照射時によりも不活化速度が大きく有意性が高いことが明らかとなった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初計画では木更津高専内に小型下水処理システムを設置する予定でいたが，コロナ禍で維持管理が困難なため，国内で実下水を処理している下水処理場より試料を提供いただくことで代替した。Ampicillin薬剤耐性遺伝子を保有する大腸菌へのCARD-FISH法の最適化として，HRPプローブおよびホルムアミド濃度の最適化を検討した。またFACSでのCARD-FISH法の適用のため溶液中での実験条件の最適化を行った。不活化試験では，薬剤耐性大腸菌以外の微生物種についても，基礎的データの取得を行った。引き続きデータ取得を行い，不活化評価手法の構築を行う。

Strategy for Future Research Activity

下水処理汚泥内で耐性遺伝子が伝播している可能性が確認されており，今後はサンプル数を増やし追求する予定である。また，モデル耐性菌の特異的回収の最適化および次世代シークエンス解析による回収評価を行うとともに，実環境サンプルを用いた薬剤耐性遺伝子の特異的検出および回収実験を進める。不活化試験では，継続してデータを蓄積していくとともに、主波長の異なる紫外線ランプを評価するために評価軸として，消費電力あたりの不活化効率をある一定の数量で示すことができる指標を構築していき，各種病原微生物の不活化評価モデルの確立を試みる。