2021 Fiscal Year Annual Research Report
Development of innovative human tumor models using cell patch method for high-speed three-dimensional organization
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19H04454
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| Research Institution | Tokyo Women's Medical University |
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Principal Investigator |
中山 正道 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (00338980)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
増田 信奈子 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (30342851)
関根 秀一 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (60541737)
原口 裕次 東京女子医科大学, 医学部, 特任准教授 (80272251)
秋元 淳 国立研究開発法人理化学研究所, 創発物性科学研究センター, 研究員 (80649682)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 腫瘍モデル / 細胞パッチ / がん組織工学 / 灌流培養 / 担癌モデル動物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、温調制御した遠心操作により、がん細胞およびその関連細胞を高密度充填組織化したがん前駆組織体（がん細胞パッチ）を作製する。がん細胞パッチの構造的・機能的特徴を明らかにしながら、より生体がんに近いin vitro灌流がん組織モデルとin vivo移植がんモデルを構築する。
前年度同様に、各種ヒトがん由来細胞株をサイズが異なるウェルの培養基材に添加後、過重力付加と作用時間を変化させることで効率的な細胞パッチの作製について検討した。前年までに検討した条件（過重力220G、10分間）において、ヒト子宮頸がん由来細胞株のHeLa細胞では、遠心操作後に24時間、37℃で静置培養することで安定な細胞パッチ組織を作製できたが、細胞－細胞間ジャンクションが脆弱な細胞株では、安定な組織を構築することが困難であった。そこで安定な組織構築を目的として、過重力付与を290Gに増加した結果、5分間に短縮した遠心操作においても作製組織の安定性に改善がみられた。
作製したがん細胞パッチの転写操作を検討した結果、9%ゼラチンを塗布した市販の細胞シート回収用支持体を用いることで、別基材に容易に転写できることが明らかになった。本手法を利用し、ヒト肝がん細胞株HuH-7から作製した細胞パッチ（8-mm径、80万細胞）を免疫不全ラットに皮下移植した。しかし、3週間経過後においても腫瘍形成は確認できなかった。現在、検討継続中である。
両親媒性ブロック共重合体を物理コートした低細胞吸着性基材を用いることで、緩やかなピペッティング操作で細胞パッチを基材から容易に回収することが可能となった。本手法は多くの細胞種で安定な細胞パッチを形成するのに有効である一方、特定の細胞から作製した細胞パッチでは、形成した組織の収縮性が高く、37℃の静置培養中に数時間で自発的に剥離してしまう特長も確認されている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
遠心操作および37℃における静置培養時間の検討により、各種がん細胞株（肝臓、子宮由来など）から細胞パッチを安定に作製することが可能となってきた。特に培養皿に４穴のシリコーン樹脂製チャンバーを設置することで、同時に複数個（最大16個）のパッチ組織を均一に作製することが可能である。現在、薄型ゼラチンゲル支持体に吸着させることでがん細胞パッチを免疫不全小動物に皮下移植し、腫瘍形成能を評価している。これまでのところ、安定な腫瘍形成が確認されていない。細胞種によっては、腫瘍形成に最適な細胞数や長期な日数を要するものも存在する。そこで、安定して腫瘍形成が確認されているがん細胞株から細胞パッチを作製し、腫瘍形成能を評価する。また、肝臓がん由来細胞パッチに関しては、皮下組織より血流が豊富な肝臓への同所移植がより効果的であると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
がん細胞パッチの作製では、ヒト由来がん関連細胞（がん細胞、がん線維芽細胞、血管内皮前駆細胞など）を37℃で遠心操作を行うことで細胞パッチ化する。細胞―細胞間ジャンクション形成が脆弱ながん細胞株を用いた場合、作製した細胞パッチが崩壊しやすいことが明らかになっている。そこで、細胞パッチを安定に培養・回収するためのプロトコールの確立と培養器材の開発を継続して行う。がん細胞パッチの免疫染色した薄切切片を利用して組織学的解析を行うとともに、細胞パッチ組織内における血管内皮細胞のネットワーク形成能などの３次元共培養系としての特徴を明らかにする。
がん細胞パッチ移植による移植がんモデルの構築では、がん細胞パッチの生着率と腫瘍形成能の検証のために、皮膚切開した免疫不全小動物の皮下または同所臓器への移植をおこなう。腫瘍薄切切片を免疫染色法で組織学的観察を行いつつ、細胞パッチ移植法の有効性を明らかにする。
in vitro腫瘍モデルの検討では、流速や培養液組成などの基礎条件を最適化しつつがん細胞パッチの灌流培養を行う。静置培養と比較して、組織厚の違いや形態学的変化および分子生物学的特徴を明らかにする。
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Research Products
(2 results)
