Industrial application of nylon-degrading enzymes

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K05171
• Research Institution: University of Hyogo
• Principal Investigator: 根来 誠司 兵庫県立大学, 工学研究科, 特任教授(名誉教授) (90156159)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 武尾 正弘 兵庫県立大学, 工学研究科, 教授 (40236443) ; 加藤 太一郎 鹿児島大学, 理工学域理学系, 助教 (60423901)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: ナイロン / リサイクル / プラスチック / 酵素分解 / 立体構造 / 熱安定性

Outline of Annual Research Achievements

ナイロン分解酵素は、これまで、大腸菌で発現後、イオン交換・ゲルろ過クロマトグラフィーにより精製していたが、より多量の酵素を迅速に調製するため、酵素のアミノ末端領域にHis-tagを付加し、遺伝子の高発現化が可能な組換えプラスミドを構築した。まず、本酵素の立体構造に基づき、His-tag付加の構造変化に及ぼす影響について予測した。この結果に基づき、pColdIベクターのFactorXaサイトの直後にNylC-GYAQ遺伝子の開始コドンが挿入された発現ベクターpColdI-HisGYAQを構築した（SLiCE法）。その結果、酵素の大量調製が可能となったが、His-tag付加の影響で、活性や熱安定性が低下する可能性があるため、得られた酵素について、性質付けを行った。熱安定性については、取得したHis-tag化酵素をCD測定装置を用いて測定した。測定試料を1℃/分の速度で25℃から95℃まで上昇させ、220nmにおけるモル楕円率（θ）の変化を測定した。従来は、Tm値は熱変性曲線から作図法で求めていたが、精度を高めるため、科学計算解析プログラムIgor Pro8のマクロファイルを用いて、熱変性理論式に基づいて、熱変性温度と熱変性のエンタルピー変化を算出した。対照として、His-tagが付加されていないNylC-GYAQ変異体の熱変性データについても、同様の解析を実施した。その結果、His-tagGYAQ変異体の熱変性温度（Tm値）は８４℃であり、親型NylCよりも３０℃高く、高温での酵素反応の実施が可能であること、His-tag付加により熱変性Tm値が約１℃低下するが、実用上は問題がないと判断した。また、酵素分解産物の詳細な情報を得るため、モノマーユニットが異なる種々のナイロンについて、ナイロン分解酵素で分解後、反応産物を、高分解能の質量分析（LC/MS）、核磁気共鳴（NMR）により分析した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

NylCは変異により、安定性・分解様式・有機溶媒効果が大きく影響を受けることが分かっているため、実用レベルで有用な酵素を取得するためには、広範囲の変異体ついての検討が重要である。しかし、現有する大腸菌クローンを初発材料とした場合、酵素発現量が低く、また、多段階の精製工程を要するから、迅速に変異酵素の調製が可能な発現・精製系の構築が必要であると判断した。これまで、ナイロン分解代謝の下流の反応を触媒するNylD、NylEについて、 pColdIベクターを用いたHis-tag化酵素の高発現化に成功している。そこで、同様の手法をNylCおよびその変異体の調製に適用することにした。その結果、期待どおり、酵素の迅速調製が可能になり、得られた酵素は、安定性・機能面でも問題がないことを確認した。

Strategy for Future Research Activity

NylCは少数のアミノ酸置換で自己分断特性が消失し、不活性な前駆体で止まる場合や、タンパク質が凝集し不溶性になることが明らかになっている。今年度の検討から、NylC-GYAQ変異体とNylC親型酵素の何れでも、酵素活性が確認できた。従って、同様の方法で多数のNylC変異体をHis-tag化酵素として迅速に調製可能な実験系が構築できたといえる。しかし、精製酵素のSDS-PAGE分析から、NylCポリペプチドの約３０％は不活性な前駆体に止まり、活性型への変換が部分的であることが判明した。次年度は、効率的に活性型酵素への変換が可能な条件（培養温度、時間等）について検討する。また、ナイロン薄膜の作製や、ポリマー試料の均一分散が可能な方法論について検討し、高分子量のポリマーを効率的に分解可能な条件を選定する。

Research Products

• [Journal Article] Structural and functional characterization of nylon hydrolases (2021)
  • Author(s): Seiji Negoro, Dai-ichiro Kato, Taku Ohki, Kengo Yasuhira, Katsumasa Kamiya4, Yasuteru Shigeta, Yasuyuki Kawashima, Keisuke Nagai, Masahiro Takeo, Naoki Shibata,
  • Journal Title: Methods in Enzymology Volume: 648 Pages: 357-389
  • DOI: 10.1016/bs.mie.2020.11.004.
  • Peer Reviewed