2021 Fiscal Year Research-status Report
Industrial application of nylon-degrading enzymes
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19K05171
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
根来 誠司 兵庫県立大学, 工学研究科, 特任教授(名誉教授) (90156159)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
武尾 正弘 兵庫県立大学, 工学研究科, 教授 (40236443)
加藤 太一郎 鹿児島大学, 理工学域理学系, 助教 (60423901)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ナイロン分解酵素 / ポリアミド / 再資源化 / 耐熱性酵素 / プラスチック分解 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、純度の高い精製酵素を取得することが重要であるが、ナイロン分解酵素（ＮｙｌＣ）は、不活性な前駆体として発現し、自己触媒的な特異的切断により、活性化酵素へ変換されるという特長を有する。 この自己分断は、タンパク質の構造変化（特にサブユニット界面の変化）によって影響されるため、安定してナイロン分解酵素を調製するための方法論について検討した。まず、現有する未発表の蛋白質構造解析データや、新規解析で得た構造の着目部位の距離計測、および、相互作用部位の解析から、有用酵素構築の分子設計、特に、有望なアミノ酸置換の選定、遺伝子組換え・タンパク質工学技術を駆使した遺伝子の構築、酵素精製と反応条件の検討を実施した。ナイロン分解酵素の産業応用では、酵素の安定化と迅速調製が必要である。そのため、His-tag化NylC酵素を大腸菌で高発現するプラスミドを構築し、同酵素の特徴付け（熱安定性の評価とナイロンオリゴマー基質に対する活性測定）を実施した。得られた酵素を高分子量のナイロン基質と反応させ、NMR、LC-MS分析を行ったところ、ナイロンオリゴマー成分の分解を確認することができた。さらに、本酵素の立体構造に基づき、酵素の耐熱性が上昇した変異酵素の構築に成功した。また、高分子量基質を効率的に分解させるため、ポリマーを溶液中に均一分散させるための方法論について検討した。その結果、従来の薄膜法と比較して、分解性を６倍程度上昇させることに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
迅速精製が可能なHis-tag酵素の高発現化に成功し、熱安定性の評価とナイロン基質に対する活性測定を実施した。分解率の高い条件での反応産物のNMR分析を実施できなかったのは残念であるが、ナイロンを溶液中に均一分散させるための方法論を確立し、分解性を既存の薄膜法と比較して、６倍程度上昇させることに成功した。従って、各種ナイロン試料の分析に好適な条件を確立することができたと考える。
さらに、本酵素の立体構造に基づき、酵素の一層の耐熱性上昇にも成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
長時間反応を安定して実施可能な酵素を容易に精製する手法が確立できたことから、産業応用への展開が期待できる。各種脂肪族ポリアミドを均一分散可能な条件を確立し、同条件で効率的にナイロン分解が可能となることを確認できたのは、重要な成果と言える。本法は、分析分野のみならず、有用物質への変換などの産業応用上も有用と考える。今後、酵素分解が可能なポリアミド（特に、バイオ資源から生産したモノマーユニットを含むポリアミド）、芳香族ポリアミド、ポリウレタンなどの各種試料に対する酵素分解は、応用上、重要であるため、継続した開発が必要と考えている。
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| Causes of Carryover |
コロナ蔓延による出張規制、特に、外国出張の制限から、当初、予定していた出張旅費の支出がなかったためである。さらに、2022年度に国際論文誌への投稿を予定しているが、投稿経費として、1件あたり2500ドル程度（現在の為替レートで約32万円）の支出が必要であり、英文校閲費を含めると、40～50万円程度を次年度に繰り越す必要性があると判断した。
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[Journal Article] Structural and functional characterization of nylon hydrolases2021
Author(s)
Seiji Negoro, Dai-ichiro Kato, Taku Ohki, Kengo Yasuhira, Katsumasa Kamiya4, Yasuteru Shigeta, Yasuyuki Kawashima, Keisuke Nagai, Masahiro Takeo, Naoki Shibata,
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Journal Title
Methods in Enzymology
Volume: 648
Pages: 357-389
DOI
Peer Reviewed
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