2022 Fiscal Year Research-status Report
Industrial application of nylon-degrading enzymes
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19K05171
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
根来 誠司 兵庫県立大学, 工学研究科, 特任教授(名誉教授) (90156159)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
武尾 正弘 兵庫県立大学, 工学研究科, 教授 (40236443)
加藤 太一郎 鹿児島大学, 理工学域理学系, 助教 (60423901)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ナイロン分解酵素 / バイオナイロン / 環境負荷 / Ｘ線結晶構造解析 / リサイクル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、各種ポリマー材料について、着目する物性や機能の高度化が求められている。これまで、機器分析の高度化により、ポリマー構造の詳細が解明されつつあるが、高分子素材の直接分析では、微細構造の解析に限界がある。一方、生体高分子では、基質認識が異なる種々の酵素を用いて、その生成物の精密分析から詳細な構造解明が実現している。本年度は、特に、NylB（エキソ型オリゴマー分解酵素）とNylC（ナイロン分解酵素）について、脂肪族ナイロン（６ナイロン、６６ナイロン等）を酵素分解させ、反応前後の変化を、各種機器分析で検討し、本法の原理検証を行うとともに、反応に適切な酵素の選抜を行った。ナイロン分解酵素の工業的利用のためには、酵素の安定化が必要である。現在、親型酵素から36℃安定な酵素を取得しているが、本分析システムにて利用する上で、問題がないかを検討した。熱安定性については、取得したHis-tag化酵素をCD測定装置を用いて測定した。測定試料を1℃/分の速度で25℃から95℃まで上昇させ、220nmにおけるモル楕円率（θ）の変化を測定した。従来は、Tm値は熱変性曲線から作図法で求めていたが、精度を高めるため、科学計算解析プログラムIgor Pro8のマクロファイルを用いて、熱変性理論式に基づいて、熱変性温度と熱変性のエンタルピー変化を算出した。対照として、His-tagが付加されていないNylC-GYAQ変異体の熱変性データについても、同様の解析を実施した。その結果His-tagGYAQ変異体の熱変性温度（Tm値）は８４℃であり、親型NylCよりも３０℃高く、高温での酵素反応の実施が可能であること、His-tag付加により熱変性Tm値が約１℃低下するが、実用上は問題がないと判断した。さらに、イタコン酸含有ナイロンなど、モノマーユニットの認識が異なる種々の変異酵素の取得を試みた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
迅速な精製が可能なHis-tag酵素の高発現化に成功し、精製酵素の特徴付け（熱安定性評価とナイロン基質に対する活性測定）を実施した。また、ナイロンを溶液中に均一分散させるための方法論を確立し、分解性を既存の薄膜法、微粒子分散系と比較し６倍程度上昇させることに成功した。その結果、各種ナイロン試料の分析に好適な条件を確立することができた。さらに、本研究で構築したナイロン分解酵素は、イタコン酸を含有するナイロンなど、種々の脂肪族ナイロンへ作用することが確認でき、実用化へ有望な特性を有することが確認できた。従って、概ね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
長時間反応の実施が可能な酵素を、迅速に調製することが可能な手法が確立できたことから、応用展開が期待できる。また、均一分散系ナイロンの分析分野のみならず、有用物質への変換などの産業応用においても有用な可能性が確認できた。従って、今後は、イタコン酸含有ナイロン、4ナイロンなど、バイオナイロンとして注目されている新規ナイロンや、芳香族ポリアミド、ポリウレタンなどの酵素分解についても、継続した開発を実施していくことが重要であると考えている。
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| Causes of Carryover |
本年度の成果を、当初予定していた国際学術誌へ発表するためは、35万円程度が必要であったことから、そのための予算を残していたが、同雑誌とは別の国際誌（FEBS Journal: ヨーロッパ生化学連合が発行する雑誌）に掲載されることになった（成果の欄参照）。FEBS Journalは掲載料が不要であったため、年度末で残額を生じることになった。一方、2022年度から、アメリカ・オークリッジ国立研究所との共同研究が始まり、2023年度には海外出張の可能性があるが、必要経費が不足する可能性があることから、次年度へ繰り越すこととした。
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[Journal Article] X-ray crystallographic and mutational analysis of the NylC precursor: catalytic mechanism of autocleavage and substrate hydrolysis of nylon hydrolase2023
Author(s)
Seiji Negoro, Naoki Shibata, Dai-ichiro Kato, Yusuke Tanaka, Kengo Yasuhira, Keisuke Nagai, Shohei Oshima, Yoko Furuno, Risa Yokoyama, Kaito Miyazaki, Masahiro Takeo, Kowit Hengphasatporn, Yasuteru Shigeta, Young-Ho Lee, Yoshiki Higuchi
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Journal Title
FEBS journal
Volume: -
Pages: -
DOI
Peer Reviewed
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