2019 Fiscal Year Research-status Report
常温で生育するメタン生成アーキアを活用した難合成タンパク質産生系の開発
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19K05692
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| Research Institution | Gifu University |
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Principal Investigator |
横川 隆志 岐阜大学, 工学部, 教授 (90242304)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | メタン / アーキア / tRNA / ラジカルSAM酵素 / 無細胞タンパク質合成系 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
メタン生成アーキアは、無酸素環境下で生育しないが、その一種であるMethanosarcina acetivoransを4リットルスケールで培養し、嫌気チャンバーを活用することで酸素に触れることなく細胞抽出液を調製する工程を確立した。この工程は、大腸菌で過剰産生させた酸素感受性のラジカルSAM酵素を、無酸素環境下で精製する際に活用され、これまで20年以上不明だったアーケオシンというアーキアtRNAに特異的に見られる複雑な修飾ヌクレオシドの生合成過程に、新奇のラジカルSAM酵素が関与していることを明らかにした。
無細胞タンパク質合成系における細胞抽出液のタンパク質合成活性は、SDS PAGE上で検出されるChloramphenicol acetyltransferase (CAT)のバンドで評価してきたが、CATの合成量が安定しないので、分光学的手法を用いて定量的に活性を評価できる系を構築した。その結果、調製時には十分な活性を持つ細胞抽出液も-80℃で１ヶ月保存するとおよそ70%活性が低下してしまうことが判明した。この活性低下の原因が、好気的な保存環境と細胞抽出液成分の不活化のどちらにあるのか今後検討する。M. acetivorans細胞抽出液のタンパク質合成活性が安定しない原因の一つとして、対数増殖期後期からtRNAの構造が変化し不活化する現象を新たに見出したが、不活化を回避する方法も検討する。
常温で好気的に生育するアーキアとして、好酸性の鉄酸化アーキアFerroplasma acidiphilumの培養も行った。現在、1.5リットルまで培養スケールを拡大したが、細胞がM. acetivoransに比べて小さいため、十分量の菌体を確保できず、また細胞の効率的な破砕方法も確立できていない。まずは十分量の細胞抽出液を確保し、例えばアミノアシル化活性の至適pHを調査し、評価する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Methanosarcina acetivoransを4リットルスケールで培養し、酸素に触れることなく細胞抽出液を調製する工程を確立した。細胞抽出液のタンパク質合成活性は、CATというタンパク質がどの程度合成されるかをSDS PAGEで分析して評価してきたが、CATの合成量が安定しないので、M. acetivorans細胞抽出液のCAT活性を分光学的手法を用いて定量的に評価できる系を構築した。その系で調査した結果、十分な活性がある細胞抽出液も-80℃で１ヶ月保存するとおよそ30%の活性に低下してしまうことが判明したので、今後の解決を目指したい。
M. acetivorans細胞抽出液のタンパク質合成活性が安定しない原因の一つとして、対数増殖期後期あたりからtRNAの構造が変化し、tRNAが不活化する現象を見出しており、この現象の詳細な解析を進める。
常温で好気的に生育可能なアーキアとして、Ferroplasma acidiphilumの培養も行っている。現在、1.5リットルスケールまで培養スケールを拡大したが、細胞がM. acetivoransと比較してかなり小さいため、十分量の菌体を確保できていない。また細胞の効率的な破砕方法も確立できていないので、解決策を模索したい。
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| Strategy for Future Research Activity |
アーキアのタンパク質合成系の構築のために、引き続き、効率良い無細胞タンパク質合成系の構築を目指す。
Methanosarcina acetivoransの細胞抽出液のタンパク質合成活性は、集菌のタイミングに左右されるが、その原因の一つにtRNAの構造変化があることが判明した。そこで、tRNAの構造変化の詳細を質量分析装置を用いて解析し、不活化を回避する方法を探る。また、細胞抽出液の活性が保存中に失われる原因が、超低温冷凍庫が好気的な環境にあるためなのかを検証する。具体的には何重にも嫌気的な密閉容器に覆われた状況でも失活するのかを見極めたい。
Ferroplasma acidiphilumから十分量の細胞抽出液は得られていないが、培養は簡単なので、スケールアップは可能である。また細胞の破砕方法についても鉄イオンをキレートすると細胞が溶菌しやすくなるようなので、少量でも細胞抽出液を調製し、タンパク質合成系の至適pHを、例えばアミノアシル化活性などで評価する。至適pHが極端に低い場合は、汎用的なタンパク質合成系としては適さないので、対象から外すことも検討する。
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