アスベストを高度に認識するタンパク質の創製

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K05814
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 石田 丈典 広島大学, 統合生命科学研究科(先), 講師 (30573373)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 不凍タンパク質 / ファージディスプレイ法 / アスベスト結合タンパク質 / アスベスト / 無機結晶結合タンパク質

Outline of Annual Research Achievements

アスベストは、肺ガンや悪性中皮腫などを引き起こす。アスベストに結合するタンパク質を発見し、アスベストの検査方法に応用することに成功している。この検査方法を世界標準化するためには、毒性の異なるクロシドライトとアモサイトを区別する必要があり、そのためにタンパク質の特異性をさらに向上させる必要があった。アンチフリーズタンパク質(AFP)は、氷に結合するユニットが繰り返した構造をもつ天然の無機結合タンパク質である。本研究では、AFPの繰り返しユニットの変異ライブラリーを構築し、進化工学を利用することで、これまでにない高い特異性を持ったアスベスト結合タンパク質を作製し、固体表面を高度に認識するタンパク質を創製する新たな方法論を確立することを目指した。
不凍タンパク質として、Tenebiro molitor由来の不凍タンパク質(TmAFP)を用いた。平面構造内のスレオニン残基を、ランダムなアミノ酸で置換したTmAFPの遺伝子を設計した。具体的には、TmAFPの第37番目から第61番目のアミノ酸領域において、平面構造内に配置されている第39、41、51および53番目のスレオニン残基をランダムなアミノ酸に置換した変異型TmAFPを提示したファージライブラリーを作製した。この作製したファージライブラリーを用いて、角閃石系アスベストであるアモサイトに結合するTmAFPのスクリーニングを行なった。バイオパニングを6回行った後、得られた変異型TmAFPのアミノ酸配列の解析を行なった。解析した19個体のうち、10個体がAKVC(左から順にTmAFPの平面構造内に位置する第39,41,51,53番目のアミノ酸)という配列を持っており、2個体がNKRKという配列を有することがわかった。また、これらの変異型TmAFPの組み換えタンパク質の作製を行なった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

変異型TmAFPを提示したファージライブラリーを作製に成功し、角閃石系アスベストであるアモサイトに結合するファージの取得に成功している。また、これらのファージが提示している変異型TmAFPを３種類選択して、組み換えタンパク質として発現と精製を行なったところ、2種類の変異型TmAFPの精製に成功した。ファージライブラリーの作製に成功、アモサイトを対象としてスクリーニングを行ない結合ファージの取得に成功、得られた変異型TmAFPの作製も概ね成功していることから順調に進行していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

角閃石系アスベストであるアモサイトに結合する変異型TmAFPの組み換えタンパク質として精製できたため、これらの変異型TmAFPを実際にアモサイトへ結合するか評価を行なう（クロシドライトとの区別できるかも評価する）。もう一つの角閃石系アスベストであるクロシドライトに対しても、スクリーニングを行ないクロシドライトに結合するファージを取得する。得られたファージから、アモサイトとクロシドライトを区別できるような変異型TmAFPの取得を試みる。また、新しいファージライブラリーとして、T7ファージライブラリーの構築も試みる。

Causes of Carryover

【次年度使用額が生じた理由】予想よりも消耗品の使用量が少なく済んだため。また，英語論文についての校正費が今年度末までに投稿準備ができなかったため計上しなかった。
【次年度使用額の使用計画】新しいファージライブラリーとして、T7ファージライブラリの構築の費用に使用する。