2021 Fiscal Year Annual Research Report
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19K05814
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
石田 丈典 広島大学, 統合生命科学研究科(先), 講師 (30573373)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 不凍タンパク質 / ファージディスプレイ法 / 無機結晶結合タンパク質 / アスベスト / アスベスト結合タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アスベストは、肺ガンや悪性中皮腫などを引き起こす。申請者はアスベストに結合するタンパク質を発見し、アスベストの検査方法に応用した。この検査方法の精度を世界標準レベルに高めるためには、タンパク質の特異性をさらに向上させる必要があった。アンチフリーズタンパク質(antifreeze protein, AFP)は、氷に結合するユニットが繰り返した構造を持つ天然の無機結晶結合タンパク質である。本研究では、AFPの繰り返しユニットの変異ライブラリーを構築し、進化工学を利用することでアスベストに結合するユニットを取得する。このユニットを繰り返す(多点で認識する)ことで、アスベストの固体表面を高度に認識するタンパク質を創製することを目指した。
不凍タンパク質として、Tenebiro molitor由来の不凍タンパク質(TmAFP)を用いた。ランダムなアミノ酸に置換した変異型TmAFPを提示したファージライブラリーを作製した。この作製したファージライブラリーを用いて、角閃石系アスベストであるアモサイトに結合するTmAFPのスクリーニングを行なった。その結果、アスベストに結合するTmAFP変異体(アスベスト結合ユニット)が19個体得られた。そのうち14個体がAKVC(左から順に第39,41,51,53番目のアミノ酸が変異)という配列で、2個体がNKRKという配列、残りはKVKK KKEK,KHKRという配列が1個体ずつ得られた。発現が容易であったNKRKという配列を持つアスベスト結合ユニットを1から3つ提示させて、緑色蛍光タンパク質(GFP)で標識した融合タンパク質を作製し、結合性と特異性について評価を行なった。その結果、アスベスト結合ユニットが増えるごとに、アスベストへの結合量が増加した。また、特異性については、ユニット数の影響はなく、ほぼアスベスト特異的に結合することが分かった。
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