2019 Fiscal Year Research-status Report
ゲノム編集によりグルテンを改変した低アレルゲン小麦の作出
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19K05977
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
川浦 香奈子 横浜市立大学, 木原生物学研究所, 准教授 (60381935)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | パンコムギ / 小麦アレルギー / 種子貯蔵タンパク質 / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
パンコムギにおける種子貯蔵タンパク質遺伝子それぞれの発現を制御する転写因子を特定し、多重遺伝子の発現制御機構を明らかにすること、ゲノム編集技術を用いて転写因子を改変し、低アレルゲン化したコムギの作出を目的とした。
パンコムギの種子貯蔵タンパク質を制御する転写因子の候補、SPA、O2-like 、およびWPBFの遺伝子発現パターンを調べた。その結果、それぞれ種子登熟期の胚乳で発現しており、種子貯蔵タンパク質遺伝子の発現が高い時期にSPAとWPBFも発現が高い一方で、O2-likeは低くなることが示された。また、種子貯蔵タンパク質の中で特に遺伝子コピー数の多いα-グリアジンに着目し、未知の転写因子を探索するため、α-グリアジン遺伝子に共通するシス配列を用いて酵母ワンハイブリッド解析を行ったが、候補となる転写因子は得られなかった。さらに、SPAおよびWPBFについて、CRES-T法によるキメラリプレッサーを用いて転写因子の機能を抑制する形質転換系統を作出した。SPA、WPBFとも、キメラリプレッサー導入個体で、一部の種子貯蔵タンパク質の蓄積が異なる傾向があったが、キメラリプレッサーの発現が安定しないことが示唆され、これらの機能を解明するためには、ゲノム編集個体を作出する方が妥当であると考えられた。
パンコムギのCRISPR/Cas9システムによるゲノム編集の変異導入を高効率化し、従来法のDNAベクターではなく、gRNAとCas9タンパク質からなるRNP複合体をパンコムギ未熟胚に直接導入する手法の改良を行った。ゲノム編集の変異導入効率の実績があるLox2を標的とし条件検討を行ったところ、変異導入が可能なCas9タンパク質の量や導入する時の条件を決めることができた。この手法を用いて、転写因子SPAおよびWPBFのゲノム編集系統作出に取り掛かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、（１）パンコムギの胚乳特異的遺伝子発現に関連する転写因子の探索、（２）転写因子をコードする同祖遺伝子を変異させたゲノム編集系統の作出、（３）グリアジンのアレルギーの原因となるエピトープを標的としたゲノム編集系統の作出、（４）ゲノム編集による変異系統の評価、の4点を計画している。（１）については、新たな転写因子は発見されなかったものの候補転写因子を選択することができた。（２）については、ゲノム編集の手法の確立が進み、目的とする転写因子を標的としたゲノム編集作出に取り掛かることができた。これらから、おおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
パンコムギのゲノム編集系統の作出に注力する。CRISPR/Cas9システムを適用し、Cas9タンパク質とgRNAのRNP複合体を用いたゲノム編集法のさらなる高効率化を目指すとともに、選出した転写因子SPAまたはWPBFの3種の同祖遺伝子を変異させたゲノム編集系統を取得する。また、グリアジンのアレルギーの原因となるエピトープを標的としたゲノム編集系統の作出にも着手する。できるだけ早期にゲノム編集系統を取得することを目指し、ゲノム編集法の高効率化のみならず、変異の検出法等、ハイスループットな手法の確立も同時に目指す。
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| Causes of Carryover |
ゲノム編集系統作出に係る試薬を低額に抑えることができたため、消耗品費が少なくなった。また、海外の国際学会の参加をしなかったため、旅費が少なくなった。今後、ゲノム編集系統が作出できた際に、評価に消耗品費や委託費が多くかかることが予測されるため、そちらで使用する。
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