2019 Fiscal Year Research-status Report
Developing long-term preservation method for hard-to-cryopreserve ectomycorrhizal basidiomycete cultures
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19K06088
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
中桐 昭 鳥取大学, 農学部, 教授 (70198050)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
遠藤 直樹 鳥取大学, 農学部, 助教 (20776439)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 凍結保存 / バーミキュライト / 菌根性担子菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、菌株保存が困難な菌根性担子菌類の菌株の凍結保存法および凍結保存後の菌株の品質評価法を開発し、本菌群の長期保存法を確立することを目標とするものである。現在、凍結保存法として有効性が報告されているバーミキュライト法は、前培養の際に凍結用チューブの中にバーミキュライトと液体培地を入れ、その中で菌株を培養する方法（チューブ法）であり、前培養後に凍結保護剤（5％DMSO, 10％トレハロース）を添加して、プログラムフリーザーで緩慢凍結した後、液体窒素タンク等で保存する。しかし、多種の菌根性担子菌株に適用したところ、保存できない菌株が存在し、その要因として、チューブ間で菌糸生育が不揃いなこと、およびチューブ内の酸素欠乏による生育不良がある可能性が示唆された。そのため、2019年度はこれらの問題を解消し生残率をより高める新たな前培養法の開発を目指した。
菌類きのこ遺伝資源研究センターが保有する難保存性の8属10種10菌株を試験菌とし、前培養法の検討を行うために、一般的な寒天ディスク法に加えて、バーミキュライトを用いた4つの前培養法〔チューブ法のほか、新たな方法としてシャーレ法（液体培地を浸みこませたバーミキュライトをシャーレ内に敷き詰めて、菌を接種し培養を行う）・サンド法（寒天培地上にバーミキュライトを敷き、バーミキュライトの間に接種源を挟む）・埋め込み法（融かした寒天培地に埋め込んだバーミキュライトに接種する）〕での凍結直後の生残率と凍結前後の菌糸成長速度を比較した。その結果、シャーレ法は凍結・復元した７株すべてが100％の生残率で、復元までの培養期間が短く、凍結前後の菌糸成長速度に変化が少ないなど、他の方法よりも有効と判断された。一方、前培養での菌糸生育が不調で凍結できなかった株が3株あり、液体培地の選択や接種方法の検討が必要である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2019年度は、凍結保存法として効果が報告されているバーミキュライトを培養基材とした前培養法の改良を目指した。難保存性の菌根性担子菌株を用いて、一般的な寒天ディスク法およびバーミキュライトを前培養基質として用いる従来のチューブ法に加え、新たに考案したシャーレ法、サンド法、埋め込み法による凍結保存方法を比較した結果、シャーレ法が最も有効な方法であることを明らかにできた。特に、寒天ディスク法では生残率が20％であったAmanita ibotengutake TUFC 101350がシャーレ法では100％であるなど、寒天ディスク法では保存が困難な菌株がシャーレ法で保存できたことから、バーミキュライトの有効性が再認識できた。加えて、復元培養の際に、液体培地で2週間培養することで、高い生残率を得ることができることも明らかにした。液体培地による復元が有効であることは、一般的な寒天ディスク法においても10株中7株が90 %以上の生残率を得られたことに表れている。このように、前培養法にはシャーレ法を用いて、復元時には液体培養を行う改良バーミキュライト法の有効性を明らかにすることができた。以上のことから、2019年度のおおむね計画通り実施できたと判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
2020年度以降は、凍結保存後に菌株の性状が維持されているかどうかを評価する方法として、菌根形成能に基づく品質評価法を開発する。菌根合成のモデル植物であるマツと親和性を示す菌根性菌種の菌株を供試菌として、凍結保存・復元後にマツ無菌実生に接種・共培養し、菌根形成能を観察することで凍結保存の影響を評価する。菌根形成能は、菌根化率、菌糸感染度、菌根の形態形成の3項目で評価する。この評価法を用いて、寒天ディスク法、バーミキュライトを用いたシャーレ法、サンド法などによる凍結・復元後の菌体を用いて菌根合成し、それらの菌根形成能を凍結前の菌株による合成菌根および天然の菌根と比較して差異を調べ、性状保存性の評価を行う。この菌根形成能の評価結果と2019年度に凍結した保存標品を1年後に復元して長期保存性を評価する。それらを総合して、長期生残率が高く、しかも、菌根形成能が良く維持される凍結保存改良法を特定する。さらに、その方法を用いて、菌類きのこ遺伝資源センターが保有する多種多様な菌根性担子菌株および新たに野外から収集・分離する菌株を用いて改良法の汎用性を評価し、有効な凍結保存法を確立する。
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| Causes of Carryover |
支出を予定していた菌株培養資材、菌株凍結保存資材、菌株同定のためのDNAシーケンス解析費用について、他の経費からも一部賄うことができたこと、および、論文作成のための英文校閲費が発生しなかったため、約41万円の残金となった。2020年度は交付請求額90万円を含め約131万円となるが、菌根合成試験で必要な機材や試薬の購入費、英文校閲費などに充当する予定である。
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