2019 Fiscal Year Research-status Report
ゲノム科学等の先端技術を活用したノリのプロトプラスト作成法の再興と簡便化
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19K06188
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| Research Institution | Saga University |
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Principal Investigator |
関 清彦 佐賀大学, 農学部, 講師 (00264151)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
濱 洋一郎 佐賀大学, 農学部, 教授 (00243999)
永野 幸生 佐賀大学, 総合分析実験センター, 准教授 (00263038)
川村 嘉応 佐賀大学, 農学部, 特任教授 (30601603)
後藤 正利 佐賀大学, 農学部, 教授 (90274521)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | スサビノリ / プロトプラスト / ポルフィラナーゼ / キシラナーゼ / マンナナーゼ / 酵母発現系 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ノリの迅速種苗化、新品種作出に貢献可能なノリプロトプラストの、ゲノム科学等の先端技術を活用した作成技術の再興と簡便化を図ることを目的とした。まず、プロトプラスト作成に必要なノリ細胞壁多糖類分解酵素の生産菌を、養殖ノリ産地である有明海泥土から、ノリ細胞壁抽出物を炭素源とした培地で生育させ、多糖類分解能を指標に５株単離した。
５株についてドラフトゲノム解析した結果、Brevibacterium N1株はキシロシダーゼが含まれる糖質加水分解酵素ファミリーGH2, GH3, GH39の酵素遺伝子およびキシラナーゼを含むGH8の酵素遺伝子を有していた。また、Vibrio F1株がGH2, GH3 およびキシラナーゼを含むGH11遺伝子を、Vibrio T2株がGH2 およびポルフィラナーゼが含まれるGH50遺伝子を有した。
単離５株について、ノリの細胞壁主要多糖である、ポルフィラン、β-1,4-マンナン、β-1,3-キシランの分解酵素生産性を調べた。ポルフィラナーゼの基質としてポルフィランと構造が類似している寒天を、β-1,4-マンナナーゼおよびβ-1,3-キシラナーゼの基質として、緑藻ミル、海ぶどうからそれぞれβ-1,4-マンナン、β-1,3-キシランを主成分とする抽出物を調製した。F1株は、寒天、マンナン、キシランを、T2株で、マンナン、キシランを強く分解したが、他の３株では、顕著な分解は認められなかった。３株において、ノリ細胞壁抽出物を分解した理由については不明であるが、F1 , T2株ではドラフトゲノム解析データとノリ細胞壁構成多糖の分解活性は概ね合致した。
類似の構造を有する酵素については、ゲノム解析により精製、構造解析を必要とせず、短期間に同定することが可能となったが、類似構造が報告されていない酵素に関しては適応できず、精製、構造解析が必要であると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2019年度の課題は、ノリプロトプラスト作成のための【ノリ細胞壁多糖類分解酵素生産細菌の探索】、【ゲノム解析技術を用いた簡便な候補酵素の同定】であった。養殖ノリ産地である有明海泥土から、ノリ細胞壁抽出物を炭素源とした培地での生育、多糖類分解能を指標に５株単離した（現在７株）。ドラフトゲノム解析により、新規のマンナナーゼは得られなかったがキシラナーゼおよびポルフィラナーゼが同定された。同定された酵素については人工合成遺伝子を設計し、次年度ピキア酵母を用いて発現生産、その後プロトプラスト作出する準備を整えた。ピキア発現系について、β-グルカンであるキトサンを分解する組換え酵素の培養液への大量発現系を構築し、学会発表した。2019年度の目的は概ね達成し、研究は順調に進展していると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
【ノリ細胞壁多糖類分解微生物の探索】を継続的に進める。β-1,4-マンナン、β-1,3-キシランが調製できたことから、これらを資化する微生物の探索が可能となり、キシラナーゼ、マンナナーゼの同定効率の上昇が見込まれた。【ゲノム解析】および酵素遺伝子の同定に関する系は構築できたため、継続して有用酵素候補の解析を進める。2020年度は、【候補酵素タンパク質の生産】をはかる。2019年度同定された候補タンパク質を含むノリ細胞壁多糖類分解酵素について、ピキア酵母での発現に最適化した人工合成遺伝子を作出し、ピキア酵母を用いてメタノール誘導発現を用いた菌体外生産を実施する。精製酵素取得後、培養したノリ葉状体、糸状体に対して作用させ、【プロトプラスト作成の最適化】をはかる。細胞壁分解酵素の組合せ、酵素反応条件、供与ノリの状態を詳細に調べ、最適な葉状体、糸状体プロトプラストの作成条件を決定する。
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| Causes of Carryover |
2020年度の課題である、「細胞壁成分分解酵素のピキア酵母の発現」のために、2019年度内にピキア酵母での発現に最適化した人工合成遺伝子の作出が、2020年度に入ってしまったため。
2020年度初めに人工合成遺伝子作出費用が計上される予定である。
研究の進捗は概ね予定通りであり、13万円の人工合成遺伝子作出費用が繰り越される以外は予定通りの使用を計画している。
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