2021 Fiscal Year Research-status Report

ゲノム科学等の先端技術を活用したノリのプロトプラスト作成法の再興と簡便化

Research Project

Project/Area Number	19K06188
Research Institution	Saga University
Principal Investigator	関清彦佐賀大学, 農学部, 講師 (00264151)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	濱洋一郎佐賀大学, 農学部, 教授 (00243999) 永野幸生佐賀大学, 総合分析実験センター, 准教授 (00263038) 川村嘉応佐賀大学, 農学部, 特任教授 (30601603) 後藤正利佐賀大学, 農学部, 教授 (90274521)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2023-03-31
Keywords	スサビノリ / プロトプラスト / アガラーゼ / ポルフィラナーゼ / キシラナーゼ / マンナナーゼ
Outline of Annual Research Achievements	ノリの迅速種苗化、新品種作出に貢献可能なノリプロトプラストの、ゲノム科学等の先端技術を活用した作成技術の再興と簡便化を図ることを目的とした。ノリにおいては、細胞間充填多糖であるポルフィラン、細胞壁構成多糖であるマンナンとキシランが存在しているが、ゲノム編集等の技術応用にはこれら多糖を分解したプロトプラストにすることが有用であるため、これら分解酵素の大量調製を試みた。ノリ細胞壁を構成する多糖類(ポルフィラン、β-1,4-マンナン、β-1,3-キシラン)分解酵素生産菌を有明海泥土から単離し、プロトプラスト生産能を有する酵素を生産する細菌を選抜した。各分解酵素生産菌のドラフトゲノムを解析し、ポルフィラナーゼ、β-1,3-キシラナーゼを同定した。しかし、マンナナーゼは同定できなかった。得られたポルフィラナーゼおよびβ-1,3-キシラナーゼの配列情報を基に、ピキア酵母を用いた酵素遺伝子の大量発現を目指しピキア酵母発現に最適化した人工遺伝子を合成し組換え酵素の高生産を試みた。マンナナーゼに関しては、プロトプラスト生産実績のある酵素の配列を基にピキア酵母発現系を構築した。酵母培養液１ Lあたり、400 mgから1500 mgの組換えタンパク質の高生産に成功した。しかし、組換えタンパク質は、高分子の糖鎖が付加したためか、多糖分解活性を示さなかった。ピキア酵母発現系は高生産性を示したが、今回得られた海洋細菌由来の多糖分解酵素の生産には適していなかった。今後、菌体外に分泌生産可能であるBrevibacillus菌を用いた発現により、組換え酵素を生産しプロトプラスト大量調製系を構築することにした。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason プロトプラスト作成に有用なポルフィラナーゼ、β-1,4-マンナナーゼ、β-1,3-キシラナーゼ生産菌を単離することに成功したため、【ゲノム解析】を実施し、２種のポルフィラナーゼおよび１種のキシラナーゼ遺伝子を同定した。しかし、マンナナーゼ遺伝子を同定することができなかった。酵素遺伝子の同定を継続して進めている。【候補酵素タンパク質の生産】については、ピキア酵母を用いた発現系を構築し、さらに最適化を進め組換え酵素の高生産には成功したが、糖鎖付加のためか酵素活性を示さなかった。宿主に適した人工遺伝子合成および発現系の構築は最適化されたため、今後宿主を細菌（brevibacillus）に変え、酵素の大量調製を実施する。コロナウイルス問題の影響のため進捗に遅れが出たため、１年間の期間延長を申請した。
Strategy for Future Research Activity	【ゲノム解析】有用酵素の探索および有用酵素遺伝子の同定を継続して進める。【候補酵素タンパク質の生産】については、brevibacillusを用いた細菌分泌発現系を構築し、組換え酵素を大量生産する。【プロトプラスト作成の最適化】では、組換え精製酵素を用い、培養したノリ葉状体に対して作用させ、最適化・効率化をはかる。細胞壁分解酵素の組合せ、酵素反応条件、供与ノリの状態を詳細に調べ、最適な葉状体プロトプラストの作成条件を決定する。
Causes of Carryover	【候補酵素タンパク質の生産】について、ピキア酵母を用いた発現系を構築し、さらに最適化を進め組換え酵素の高生産には成功したが、糖鎖付加のためか酵素活性を示さなかったため、実験系を切り換えることにした。コロナウイルス問題の影響のため進捗に遅れが出たため、１年間の期間延長を申請した。宿主に適した人工遺伝子合成および発現系の構築は最適化されたため、宿主を細菌（brevibacillus）に変え、酵素の大量調製を実施し、昨年度実施できなかったプロトプラスト作出実験を実施する。