有機態リン再生過程とリン酸-酸素安定同位体解析に基づくリン循環の解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K06196
• Research Institution: Research Institute for Humanity and Nature
• Principal Investigator: 池谷 透 総合地球環境学研究所, 研究部, 外来研究員 (70361590)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 奥田 昇 京都大学, 生態学研究センター, 准教授 (30380281) ; 伴 修平 滋賀県立大学, 環境科学部, 教授 (50238234) ; 石田 卓也 広島大学, 先進理工系科学研究科(総), 助教 (70759571) ; 丸尾 雅啓 滋賀県立大学, 環境科学部, 教授 (80275156)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 有機態リン / オルトリン / イオンクロマトグラフィー / リン酸酸素安定同位体 / リン酸エステラーゼ / エクトエンザイム / 微生物メタゲノム / 次世代シーケンサー

Outline of Annual Research Achievements

有機態リンが、リン循環における再生過程でどのように利用されるかを明らかにするために、連結内湖と湖内に流入する２つの水路で試料を採取し、リン酸エステル結合に対して加水分解作用の異なる複数種のリン酸エステラーゼを用いることにより、分解基質濃度を成分ごとに調べるための分析手法を検討した。従来、用いられてきたモリブデン青法では、反応試薬に含まれる硫酸酸性によって有機態リンのかなりの割合が分解されて反応リン（SRP）として検出されるために、リン酸エステラーゼの加水分解で起こる変化を直接捉えることが出来ない。イオンクロマトグラフィーを用いることにより酵素分解反応によって生じるオルトリン濃度変化を測定することで、リン酸エステル結合の違いに基づく有機態リンの成分ごとの把握が可能になった。測定系が成立するうえで、微生物の取り込みや分解による変質を避けた試料の保存や分解反応中に生成するオルトリンの再取り込みの抑制が必要である。そのために、検討試料を現場で採取し、試料調整について検討を進めた。さらに、分解反応条件の検討を経て、有機態リンの濃度を成分ごとに測定することに成功した。
非灌漑期の試料についてアルカリホスファターゼ・無機ピロホスファターゼ・ホスホジエステラーゼI・5'-ヌクレアーゼによるオルトリンの生成量を求めたところ、これらのリン酸エステラーゼによる分解量はペルオキソ二硫酸カリウムによる分解量の80%程度に相当し、その多くはヌクレアーゼなどジエステラーゼの分解によるもので、モノエステラーゼであるアルカリホスファターゼの分解量は4%程度だった。核酸が基質となるホスホジエステラーゼIと5'-ヌクレアーゼによる分解量はほぼ同じで、ペルオキソ二硫酸カリウム分解量の50%程度だった。無機ピロホスファターゼによる分解量はヌクレアーゼの1.4～1.5倍であることが明らかになった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

１）リン酸エステラーゼによる分解反応のモデル基質として、ウンベリフェロン蛍光を生成する基質(4-Methylumbelliferyl Phosphate・4-Methylumbelliferyl pyrophosphate diester)を用いることにより、酵素反応速度の測定を簡便に行うことが出来るようになった。また、加水分解反応による蛍光とリンの生成の同時測定をすることにより、アルカリホスファターゼや無機ピロホスファターゼによるオルトリンの生成収率がCCCPやCAP共存下でウンベリフェロン分子生成に対して１前後となり、生成したオルトリンが的確に測定できていることを確かめた。一方、ジエステラーゼの反応速度は二価陽イオンの影響を強く受けることを確認し、塩化マグネシウムを用いてイオンクロマトグラフィー測定条件と共に分解反応条件の最適化を図った。
２）脂溶性弱酸型脱共役やリン酸化阻害効果が知られているCCCP(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone)とたんぱく質合成阻害剤であるCAP(Chroramphenicol)を、予め、ろ過によって微生物・懸濁物を除去した冷凍保存試料に添加することにより、保存中の酵素による分解や微生物の取り込み、さらに、分解反応中のオルトリンの微生物による再吸収を抑えるのに有効なことを確かめたが、リン酸エステラーゼの酵素活性を阻害することにもなる。このため、一定の反応速度を得るための条件検討の作業が想定以上に必要になった。

Strategy for Future Research Activity

イオンクロマトグラフィーを用いた有機態リン基質量の測定では、複数種のリン酸エステラーゼを組み合わせることによって、リン酸エステル結合の形態の差異に基づく有機態リン濃度を見積もることができる。
１）無機ピロホスファターゼとヌクレアーゼを同時に作用させることにより、各酵素を単独で作用させた場合に比べてオルトリン生成量がどう変化するかについて検討を進める。
２）他の保存試料についても分析を進め、有機態リンが湖内に流入した後、微生物群の作用を受けて、連結内湖のなかでどのように変化するかについて考察を進める。これまでの解析結果により、滞留時間の変化に応じてプランクトン微生物群のリン制限強度が変わると考えられることから、流入量やリン制限に応じて湖水中の有機態リンの消長が微生物群の変化とどのように対応するのかについて検討を行う。
３）リン酸エステル結合が加水分解を受けるときに生じる同位体平衡値の変化は、酵素反応ごとに異なることが報告されているため、湖水中の分解基質とリン酸エステラーゼの分解活性の変動から、既に得られている同位体比の変化との対応関係について検討する。
４）サイズ分画を変えたろ過試料の測定結果から、2μm以下で定義される溶存態画分よりも大きなGF/Fろ液画分中にも、エステラーゼの分解を受ける基質が30%程度存在するという結果が得られている。プランクトン群集の変化に伴い、マイクロ粒子がどのように消長するかについても留意して検討を進める。

Causes of Carryover

有機態リンの定量分析の進ちょくや論文投稿が予想以上に遅れ、酵素などの関連する消耗品類の購入や投稿費が繰り越されたため、次年度に繰り越すことになった。現在、分析を進めており、順次、成果報告を進めて行く予定である。

Research Products

• [Book] 流域ガバナンス (2020)
  • Author(s): 脇田 健一、谷内 茂雄、奥田 昇
  • Total Pages: 470
  • Publisher: 京都大学学術出版会
  • ISBN: 978-4-8140-0303-7