2019 Fiscal Year Research-status Report

Role of NPR1 gene in regulating Susabi-nori (Porphyra yezoensis) immunity

Research Project

Project/Area Number	19K06231
Research Institution	Fisheries Research and Education Agency
Principal Investigator	安池元重国立研究開発法人水産研究・教育機構, 中央水産研究所, 主任研究員 (20604820)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	福井洋平国立研究開発法人水産研究・教育機構, 中央水産研究所, 主任研究員 (40565561) 中村洋路国立研究開発法人水産研究・教育機構, 中央水産研究所, 主任研究員 (90463182)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	ノリ養殖 / 生体防御 / あかぐされ病 / ゲノム編集 / トランスクリプトーム
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、ノリの生体防御機構を制御する最重要候補遺伝子として、近年申請者らが同定したスサビノリのNPR1（nonexpressor of pathogenesis-related genes 1）遺伝子に着目し、その遺伝子破壊株を作製することでNPR1がどのようにして病原体に対するスサビノリの抵抗性獲得に関与しているのかについての解明を進めている。令和元年度（初年度）は、スサビノリのNPR1遺伝子欠損株の作製に向け、本遺伝子の3つの保存された機能ドメインについて、ゲノム編集（CRISPR-Cas9システム）により切断する標的塩基配列（20塩基）候補を5個ずつ（合計15個）設計した。それら標的領域の位置や活性予測、オフターゲット（標的配列以外の類似の配列）が無いかどうかを考慮して、最終的に5つの標的塩基配列を選出した。そして、それら5つの標的塩基配列に相補的な一本鎖ガイドRNA（sgRNA）を人工合成し、それらsgRNAとDNA 切断酵素Cas9 タンパク質の複合体（RNP: ribonucleoprotein）を調製し、標的領域を含むPCR断片を切断することが出来るのか検証した。その結果、5種類のすべてのRNP複合体が標的領域を切断することが、in vitroの実験で確認できた。それら5種類のゲノム編集ツール（sgRNA/Cas9 RNP）をスサビノリのプロトプラストにエレクトロポレーション法（電気穿孔法）により導入し、NPR1遺伝子欠損株の作製を試みた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 今年度、スサビノリにおいて、NPR1遺伝子欠損株を作製するためのゲノム編集ツールを開発することが出来た。これにより、NPR1遺伝子がノリの生体防御機構の構築に果たす役割について分子レベルで解析するための素材が準備できたことから、計画予定通りに進んでいると考えている。
Strategy for Future Research Activity	1)NPR1が関与するパスウェイ・分子ネットワークの推定：NPR1遺伝子機能欠損株および対照株（コントロール）の培養液にサリチル酸（植物の免疫応答を誘導するシグナル分子）を添加し、トランスクリプトーム解析により、NPR1の破壊により影響を受ける遺伝子群を同定し、NPR1が関与するパスウェイ・分子ネットワークを推定する。 2)NPR1が直接的な防御因子であるキチナーゼやβグルコシダーゼの活性に影響を及ぼしているのか？についての検証：サリチル酸で刺激した欠損株と対照株のホモジュネートを用いて、キチナーゼおよびβグルコシダーゼ活性を測定し、比較する。さらに、それらホモジュネートの抗菌活性に違いが見られるのかについて、平板培養法を用いた、あかぐされ菌の生育阻害試験により調べる。 3)実際にNPR1機能欠損株が病原体に対して弱くなるかの確認：欠損株と対照株の葉体から直径1mmの葉体ディスクを打ち抜き、そのディスクに、あかぐされ菌を感染させ、1日培養した後、光学顕微鏡で感染箇所数および感染細胞数を計数し、あかぐされ菌の感染度合いを比較する。
Causes of Carryover	スサビノリでゲノム編集を行った例は論文等で発表されておらず、どのようなゲノム編集ツールが使用可能なのかやゲノム編集ツールのスサビノリの細胞への導入方法等が不明であり、数多くの試行錯誤が必要だと考えていた。しかしながら、実験前に他生物のゲノム編集に関する論文等の情報収集を徹底して行い、スサビノリに応用可能だと思われた最良の方法を考案し試したところ、想定していたよりも効率的に開発できたことから、試薬代を抑えることが出来た。生じた余剰金は次年度予定していたマイクロアレイによるトランスクリプトーム解析を次世代シーケンサーによるRNA-Seq解析に変更し、より詳細なトランスクリプトーム解析を行うために有効に使用する。