2019 Fiscal Year Research-status Report
Structural-biology study on initiation mechanism of telomere bouquet formation
| Project/Area Number |
19K06505
|
|---|
| Research Institution | Hokkaido University |
|---|
Principal Investigator |
田中 勲 北海道大学, 先端生命科学研究院, 名誉教授 (70093052)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
姚 閔 北海道大学, 先端生命科学研究院, 教授 (40311518)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | テロメアブーケ形成 / 減数分裂 / リボソーム生合成因子 / Ebp2 / Rrs1 / 染色体 / 構造解析 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
リボソームは、蛋白質の合成という、生命にとって基本的に重要な役割を担う粒子である。従って、そのリボソームを合成する生合成因子は、生命を維持するのに必須の因子である。我々は、リボソームの前駆体である90Sの成熟に関わる生合成因子Rrs1とRpf2の複合体構造を得て、それらが強固な結合をしていることを示した。一方、近年、Rrs1がもう一つの生合成因子であるEbp2とともに、有性生殖細胞の減数分裂においてテロメアブーケと呼ばれる染色体の集合体の形成に必須の因子であることが報告された。そこで、我々は、Rpf2もこの過程に関与すると推測して、これら３つの因子は、核膜に局在するテロメアアンカー蛋白質Mps3に結合して、染色体集合開始の制御をしていると考えた。本研究では、リボソーム生合成因子Rrs1, Rpf2，Ebp2とテロメアアンカー蛋白質Mps3との相互作用の詳細を構造生物学的に解析し、これらの因子による染色体テロメアの集合開始の制御機構を解明する。
令和元年度には、機能解析および構造解析に適用できるRrs1、Rpf2、Ebp2、Mps3(NTD)の大量調製を行った。そのうちMps3(NTD)については、Co-cage-1を用いて初期結晶を得た。またNative-pageを用いた実験では、様々な条件でEbp2が、直接では無く、Rrs1-Rpf2を介してMps3(NTD)と結合するということが示唆されたが、これを完全に証明するため、サンプルのコンストラクトを再構築し、Niアフィニティーカラムを利用して、４者の結合を調べた。その結果Ebp2がRrs1-Rpf2を介してMps3(NTD)と結合するということを証明した。今後、結合条件を最適化し、4者複合体の相互作用を明らかにし、構造解析を進めることによって、テロメアの集合開始の制御機構の解明を試みる。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画通りに、
１．Rrs1、Rpf2、Ebp2、Mps3(NTD)それぞれの大量調製を行い、調製量と純度を向上するため、精製条件を最適化した。２．大量調製したMps3(NTD)については、Co-cage-1を用いて初期結晶を得ることができた。３．Ebp2、Rrs1、Rpf2、Mps3(NTD)という4者複合体の結合証明は、Native-pageを用いた実験では、２種類の３者複合体Ebp2-Rrs1-Rpf2、Rrs1-Rpf2-Mps3(NTD)、および４者複合体Ebp2-Rrs1-Rpf2-Mps3(NTD)のバンドが区別できないため難航したが、サンプルのコンストラクトを再構築し、Niアフィニティーカラムを利用して、Ebp2がRrs1-Rpf2を介してMps3(NTD)と結合することを証明することができた。
以上、研究はおおむね順調に進展していると言える。
|
| Strategy for Future Research Activity |
初期の計画の通りに進めるが、4者複合体の確認ができたため、研究計画にEbp2のパートナーBrx1との関係解析を加えることにした。
１．Ebp2のパートナーBrx1の大量調製を行い、Brx1がEbp2、Mps3(NTD)、Rrs1-Rpf2、Rrs1-Rpf2-Mps3(NTD)、Ebp2-Rrs1-Rpf2-Mps3(NTD)と相互作用するかどうかを調べ、Brx1がテロメアの集合開始の制御に関与するかどうかを明らかにする。
２．結晶構造解析、ネガティブ染色電子顕微鏡解析、クライオ電子顕微鏡解析、SEC-SAXS解析などの方法を用いてRrs1-Rpf2-Mps3(NTD)の3者複合体、Ebp2-Rrs1-Rpf2-Mps3(NTD)の４者複合体、さらに各因子の結合による動的な構造変化を明らかにし、運搬開始のスイッチ機構の解明につなげる。また上記１の結果によっては、構造解析の複合体にさらにBrx1を加える。
|
| Causes of Carryover |
(状況）
2019年度は、相互作用の実験に集中して、構造解析のためのデータ測定出張や、試薬、実験器具類の購入について検討し節約に努めた結果、90万円の使用残高が生じたが、これを2020年度の研究計画に追加したEbp2のパートナー分子Brx1の複合体形成への関与を解明するための研究に使用予定である。
(使用計画）
2020年度の助成金220万（2019年度90万円、2020年度130万円）のうち、一般試薬および結晶化用試薬類、ガラス器具類物品費として110万円、大型放射光施設での回折データ収集や学会参加のための旅費として60万円、その他、論文の英文校正や、論文投稿のための50万円を計上する。
|
