力学的相互作用に基づく血管新生における細胞往復運動の動態解析

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K06578
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 田久保 直子 東京大学, アイソトープ総合センター, 特任助教 (60447315)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 血管新生 / 細胞動態 / バイオイメージング

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、不均一な動態を示す細胞集団が統合された機能体である血管を形成するメカニズムの解明である。具体的には、血管新生におけるUターン動態を含む内皮細胞のマクロスコピックな動態特性および動態メカニズムを定量的に明らかにする。特に、細胞群の力学的相互作用が個々の細胞動態パターンに及ぼす影響を明らかにし、細胞動態メカニズムを細胞の力覚応答の観点から明らかにする。
前年度までに、マウス大動脈組織片を用いたin vitro血管新生モデル（大動脈リングアッセイ）において、内皮細胞が血管伸長方向に進行後、方向転換して新生血管部根元まで逆走する興味深い細胞往復運動（Uターン動態）を発見した。 ( N. Takubo, et. al. Sci. Rep. 9, 9304 (2019))。また、前年度確立した培養内皮細胞（マウス膵臓由来内皮細胞（MS-1））のみから構成されるin vitro ２次元血管新生モデルを用いてライブイメージングを行い、他の血管細胞からの動態への影響が無い内皮細胞固有の動態を観察した。これまでに開発した自動セルトラッキングシステムを用いて内皮細胞の１細胞動態解析を行った結果、本モデルでもUターン動態を含む不均一な内皮細胞動態が観測された。さらに、本モデルにおいて細胞配向の解析を行った結果、細胞外基質外の内皮細胞供給源において細胞集団のマクロスコピックな流れが存在することが確認された。このことから、内皮細胞供給源には細胞流が引き起こす不均一な応力場が発生していると考えられる。
今年度は、新生血管および細胞外基質外の細胞動態を定量解析するための細胞外基質精密成形技術を用いた血管新生モデルを確立した。このモデルを用いて細胞動態観察を行った結果、血管伸長と細胞外基質外のマクロスコピックな細胞流が関係することが確認された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

前年度までに発見したUターン動態のメカニズムを追及するための細胞外基質（Extracellular Matrix: ECM）精密成形技術を用いたin vitro血管新生モデルを確立した。具体的には、ジメチルポリシロキサン（PDMS）微細加工技術を用いてECMの型を作製し、培養ディッシュ上の0.3 mm x 3.0 mm x 0.3 mmの直方体ECMの形成に成功した。直方体ECMの各辺は細胞レベルでフラットであることを確認した。これにより、ECM外から内皮細胞が進入し血管構造を形成する過程を定量観察できる。また、血管伸長のECMの凹凸による影響を除くことができる。この血管新生モデルを用いて血管新生における血管内皮細胞動態観察を行った。血管内皮細胞はマウス膵臓由来内皮細胞（MS-1）を用いた。ECM外に播種したMS-1がECM内に進入する過程で血管様構造を形成することを確認した。この過程をタイムラプス観察した結果、血管伸長とECM外のマクロスコピックな細胞流が関係することが確認された。以上のように、これまでに行っていた新生血管内の単一細胞動態解析による内皮細胞動態の情報に加え、新たにECM外の細胞動態の情報も得たことにより、血管新生メカニズムの解明につながる新たな知見を得た。
また、ECM外の細胞流が引き起こす応力場の計測のために、牽引力顕微鏡（Traction Force Microscopy: TFM）システムを立ち上げた。これまでに、蛍光ビーズを埋め込んだ弾性体基板を作製した。

Strategy for Future Research Activity

今後は、今年度に引き続き、これまでに確立した細胞外基質（Extracellular Matrix: ECM）精密成形技術を用いたin vitro２次元血管新生モデルを用いて細胞動態定量解析を行う。特に、マクロスコピックな集団細胞の流れが引き起こす不均一な応力場がUターン動態などのマクロスコピックな細胞動態パターン及ぼす影響を明らかにし、血管新生における細胞集団の力学的相互作用に関する知見を得る。
具体的には、本血管新生モデルを用いて新生血管から血管外部までの細胞の動きを定量的に観察する。細胞配向や細胞速度場解析を行い、新生血管内外のマクロスコピックな細胞流を定量化する。ECM外のマクロスコピックな細胞流と血管伸長およびUターン動態などのマクロスコピックな個々の細胞動態パターンとの関係を定量的に明らかにする。
次に、今年度立ち上げた牽引力顕微鏡（Traction Force Microscopy: TFM）システムを用いて本血管新生モデルでのECM外の細胞流が形成する応力場の計測を行う。また、TFMシステムを拡張し、Uターン動態などを示す新生血管中の内皮細胞がECMに及ぼす力も可視化する。これまでの実験では、新生血管の先端や分岐点など血管構造の端部で細胞流の特異点が観察されている。本研究では、特に血管構造の特異点での細胞流とECMの力学的相互作用に着目し、血管樹状構造形成メカニズムを明らかにする。

Causes of Carryover

新型コロナウイルスの影響により学会が全てオンラインとなったので、旅費は使用しなかった。また、今年度後半は同影響により保育園が断続的に休園となり、育児のため特に応力場測定実験が大幅に遅れた。
次年度は応力場測定実験を中心に実験を進める予定である。応力場測定実験のために、消耗品等が必要である。