2020 Fiscal Year Research-status Report
リン脂質ホスファターゼによる神経軸索の細胞骨格制御と側枝形成の分子機構の解明
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19K06923
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
安村 美里 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (20533897)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 皮質脊髄路 / 軸索側枝 / リン脂質ホスファターゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
神経細胞は軸索の途中に側枝を形成し、複数の標的細胞とシナプスを形成する。これにより、神経細胞は複数の神経核に同時に信号を送ることができ、協調的な活動が可能となる。。タイムラプスイメージングによる動態解析から、側枝の出芽は軸索シャフトへのアクチン線維の集積に始まり、複数のフィロポディアを形成した後、そのうちの数本に微小管が進入することで安定化することや、安定化した側枝がその後に伸長することが明らかとなっている。しかしながら、そのような軸索の細胞骨格の変化を側枝形成領域で引き起こす分子機構については、依然として不明な点が多い。申請者らは皮質脊髄路が橋核に伸ばす側枝をモデルに研究を進め、これまでにリン脂質ホスファターゼの1つが側枝形成に関与する可能性があることを見出している。本研究は、このリン脂質ホスファターゼに着目し、細胞外のリガンドや細胞内のシグナル経路を同定することで、側枝形成時の軸索の細胞骨格制御の分子機構を明らかにすることを目的としている。
着目したリン脂質ホスファターゼの5つのファミリーメンバーのうち、昨年度の研究で解析対象として絞り込んだリン脂質ホスファターゼについて、今年度はさらに解析を進めた。大脳皮質第5b層の神経細胞でshRNAを用いてリン脂質ホスファターゼをノックダウンした時の、橋核に伸ばす軸索側枝形成への影響を詳細に解析した。また、大脳皮質の培養神経細胞にリン脂質ホスファターゼを発現させ、細胞骨格制御に関与することが知られている分子と共局在するかどうかを免疫染色により確認した。さらに、細胞骨格制御に関わる分子との結合に関わる領域を、リン脂質ホスファターゼのdeletion mutantを作製し、pull-down法で決定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2種類のshRNAを用いてリン脂質ホスファターゼをノックダウンすることで、off-target効果ではなく、リン脂質ホスファターゼが側枝形成に関与していることを示せた。また、細胞骨格制御に関わる分子との結合が確認できたので、今後、側枝形成時の軸索の細胞骨格制御の分子機構の解析が進む目処が立った。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞骨格制御に関わる分子との結合領域を欠損させたshRNA resistant型のリン脂質ホスファターゼをshRNAと同時に大脳皮質第5b層の神経細胞に発現させて、橋核への側枝形成に与える影響をレスキューできるかを解析していく。
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| Causes of Carryover |
2019年度に予定していたマウスの作製を、大阪大学医学部の動物実験施設の改修工事が決定したため2020年度に延期した。2020年度に作製を依頼する予定であったが、改修工事に遅延が生じ、2020年度中に改修後の施設に移動できないことが判明したため、遺伝子改変マウスの作製をさらに2021年度に延期することにした。このため、マウス作製費用が必要なくなったため。遺伝子改変マウスの作製を待つ間に、遺伝子改変マウスを使用せずに行える解析を進めて行く。
参加した学会が全てオンラインでの開催となり、旅費が必要なくなったため。2021年度の北米神経科学学会の開催が決定した場合は、研究成果の発表を行う。また、国内の複数の学会でも研究成果を発表する。
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Research Products
(5 results)
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[Journal Article] Combi-CRISPR: combination of NHEJ and HDR provides efficient and precise plasmid-based knock-ins in mice and rats2020
Author(s)
Yoshimi K, Oka Y, Miyasaka Y, Kotani Y, Yasumura M, Uno Y, Hattori K, Tanigawa A, Sato M, Oya M, Nakamura K, Matsushita N, Kobayashi K, Mashimo T
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Journal Title
Hum Genet
Volume: 140
Pages: 277-287
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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