2020 Fiscal Year Research-status Report
Crosstalk between the Mnk- and mTOR-signaling pathways in tumor-related translational regulation
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19K07094
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| Research Institution | Osaka University of Pharmaceutical Sciences |
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Principal Investigator |
福永 理己郎 大阪薬科大学, 薬学部, 教授 (40189965)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤井 俊裕 大阪薬科大学, 薬学部, 助教 (30580104)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 翻訳制御 / Mnk / シグナル伝達 / 細胞増殖 / プロテインキナーゼ / MAPキナーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究計画１～２に基づき、ヒトHeLa細胞を用いて、CRISPR/Cas9法によりJNK，p38MAPK，mLST8などの遺伝子ノックアウト（KO）を行なった後、Mnk-eIF4E翻訳調節系の制御に関わるシグナル伝達系の解析を行い、以下の結果を得た。
(1) Mnk1/2を活性化するMAPキナーゼ種を明らかにするために，HeLa細胞で発現しているMAPキナーゼ（p38α，p38β，p38γ，ERK1，ERK2，JNK1，JNK2）の各遺伝子の単独KO細胞あるいはダブルKO細胞を作製し、各種刺激におけるeIF4Eリン酸化を解析した。その結果、ストレス刺激によるMnk1の活性化には主にp38αが関与し，血清刺激による活性化にはERK1,ERK2の双方が関与する一方で、JNKはMnkの活性化には関与しないことが明らかになった。
(2) mTORC1阻害によるMnk2活性化のクロストーク機構を解析するためにMnk1-KO HeLa細胞を用いてさらにmLST8-KOを行って解析した。その結果，mTORC1阻害剤EverolimusによるMnk2の活性化にはmLST8が必要であることが示された。また，p38α/β/γのトリプルKO細胞では上記のクロストークが認められないことから，mTORC1阻害によるMnk2の活性化にはmTORC2を経由してp38を活性化する経路が存在する可能性が示唆された。
(3) CRISPR/Cas9法による複数遺伝子同時KOの効率を検討するために、７つの遺伝子（Mnk1, p38α/β, JNK1/2, ERK1, mLST8）の同時KOをHeLa細胞で試みたところ、全ての遺伝子に欠失変異が生じた細胞を効率よく作成できることが判明した。25個のクローンを単離して解析した結果、７クローン（28％）において７つ全ての遺伝子の発現が消失していることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
『研究実績の概要』で記したように、Mnk1/2の活性制御機構の研究計画（計画１及び２）についてはおおむね順調に進展した。またこの過程で、CRISPR/Cas9システムを用いた一過性の薬剤耐性選択法によってHeLa細胞で多数（少なくとも７個）の遺伝子を同時にノックアウトできることが判明したので、JNKやp38MAPKなどのMAPKメンバーを同時ノックアウトしてシグナル経路の解析を重点的に進めたため、この計画部分は想定以上に速く進んだ。しかし、昨年度の実施状況報告書の推進方策で計画したBリンパ腫由来細胞を用いたMnk-KOの作成には至っておらず、現在は、単球などの血球系細胞を用いて効果的なCRISPR/Cas9条件を設定している段階である。また、eIF4Eのリン酸化によるトランスレイトーム変動を解析する計画については、mRNAと翻訳開始複合体を免疫沈降する抗体の選定や解析手法の検討を行う段階に留まった。
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| Strategy for Future Research Activity |
『研究実績の概要』で記した成果を踏まえ、最終年度は研究計画１～３の完遂を目指す。特に、HeLa細胞ではCRISPR/Cas9システムによって少なくとも７個の遺伝子までの同時ノックアウトが可能であることを見出したので、JNKとp38を合わせたSAPKファミリーの全メンバーを網羅する多重ノックアウト細胞を作成して、ストレス・炎症シグナル応答におけるeIF4Eリン酸化経路を解明する研究を進めるとともに、フィードバック経路の解析も試みる。近年，Mnk阻害薬が、びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫（DLBCL）の増殖を特異的に抑制する可能性が示唆され（J. Med. Chem. 61、 3516-40、 2018）、また、がん細胞の悪性化に伴う免疫チェックポイントリガンドPD-L1の発現亢進にはMnkを介した翻訳制御が関与することが報告された（Nat. Med.25、 301-311、2019）。そこで最終年度は、各種のBリンパ腫由来細胞でMnkノックアウトを実施し、増殖抑制およびPD-L1発現制御におけるMnkの役割の解析を行う。この際、PD-L1 mRNAの5'非翻訳領域に存在する上流ORFを介した翻訳制御の解析手段としてeIF4E-mRNA免疫沈降法（RIP）を行い，これを端緒として計画３の網羅的トランスレイトーム解析を実施する。
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