2019 Fiscal Year Research-status Report
次世代シークエンサーを用いた生薬のDNA鑑定法の構築
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19K07151
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
中西 宏明 順天堂大学, 医学部, 准教授 (90392274)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 生薬 / 基原 / 次世代シークエンサー / ミトコンドリアDNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2019年度は、鹿茸の粉末に類似品が混合した場合を想定して、個々の基原動物を推定する方法を検討した。試料は、メーカーから提供されたアカシカ(Cerves elaphus)を基原とする鹿茸および漢方薬局から購入したアカシカを基原とする鹿茸と、類似品として、別の漢方薬局から購入したトナカイ(Rangifer tarandus)を基原とする鹿茸を、それぞれ粉末にして用いた。各々からDNAを抽出後、核DNA量を基準に任意の割合で混合し、総量5ngのDNAを用いて、ミトコンドリアDNAの12S rRNA、16S rRNA、COIおよびcytb領域をPCR増幅させ、次世代シークエンサーで分析した。次世代シークエンサーはMiSeq(Illumina社)を用い、2×251 サイクルでシークエンスした。解析はCLC Genomics Workbench 12を用い、エクセルにより同じ変異パターンを持つリードをまとめ、BLAST解析で各リードの相同性解析を行った。検討の結果、混合の割合の基準を核DNA量としたため、混合比とリードの割合は一致しなかったが、いずれの領域においても、アカシカの中に混入するトナカイの配列を識別できた。COI領域では、メーカー提供のアカシカ基原の鹿茸と漢方薬局から購入したアカシカ基原の鹿茸で1塩基の違いがあり、混合してもそれを指標に互いを区別することができた。粉末の状態で混合したサンプルについても検討したところ、アカシカの中に混入するトナカイの配列を識別できた。したがって、次世代シークエンサーを用いたこの方法により、混合しているかの有無および混合している動物の基原を推定できることが示唆された。今後は、他の動物由来生薬について検討を進める予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
次世代シークエンサーによる解析方法(ターゲット遺伝子と解析手法)を確立でき、実際に鹿茸とその類似品を用いた混合サンプルから、混入している類似品の動物種を特定できたため。できれば他の生薬での検討やMinIONでの解析も実施したかったが、次年度の課題としたい。
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| Strategy for Future Research Activity |
次世代シークエンサーによる解析方法を確立でき、実際に鹿茸で応用可能であったことから、2020年度は、まず他の生薬での検討を実施したい。具体的には、ムササビ科が基原動物である五霊脂と五霊脂の類似品(テンジクネズミ科が基原動物)を所有していることから、これらの混合サンプルについて検討する。また、節足動物や環形動物にも検討する予定である。また、2019年度に実施できなかったMinIONでの解析について、解析条件を決定し、まずは鹿茸について適用できるか検討したい。
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