2019 Fiscal Year Research-status Report
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19K07282
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| Research Institution | University of Fukui |
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Principal Investigator |
竹田 有加里 福井大学, 学術研究院医学系部門, 助教 (20582159)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 洞房結節細胞 / Ca2+制御異常 / シグナル伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
糖尿病患者は不整脈の発症率が高く、糖尿病患者の死亡率を著しく増加させている。その病因には高血糖による心筋細胞のCa2+ handling異常が関与すると示唆されているが、心自動能を司る洞房結節細胞のCa2+制御異常を検討した研究はない。申請者はマウス洞房結節細胞における自発的かつ局所的なCa2+放出“local Ca2+ release (LCR)”の記録に成功し、LCRの過剰な活性化が高血糖による不整脈発症に関与するとの知見を得た。本研究では高血糖のLCR増強作用機序を明らかにし、LCR制御破綻を介する洞房結節由来の不整脈発症機序を定量的に解明することを目的とする。
本年度は、まずグルコース刺激による洞房結節細胞リズム形成に対する作用を詳細に検討するため、単離マウス洞房結節細胞を5 ms毎に撮影し、細胞外液のグルコース濃度を5 mM (マウスの空腹時の血糖濃度)から20 mM (2型糖尿病dbdbマウスの平均血糖値)に上昇させ、収縮頻度の変化を記録した。20 mMグルコース刺激を行った結果、収縮間隔が一過性に延長または短縮する変則的収縮が誘発された。この結果は高血糖による不整脈発症の一因として洞房結節の機能傷害の関与することを示している。次にLCRの発生におけるミトコンドリア代謝の関与を明らかにするため、マウス洞房結節細胞にTMREおよびCa2+指示薬calbryte520 AMの同時負荷を行い、ミトコンドリアの空間分布とLCRの発生部位との位置関係を検討した。その結果、LCRは細胞内でランダムに発生しているのではなく、膜電位の深いミトコンドリアが集積する部位において、LCRの発生頻度が高いことが明らかとなった。ミトコンドリアの膜電位はミトコンドリア代謝と深く関係していることから、LCRの発生にはミトコンドリア代謝が関与することが示唆される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の予定では、グルコース刺激による変則性リズム形成へのLCRの関与を解析するため、Ca2+指示薬Calbryte520 AMを負荷したマウス単離洞房結節細胞の収縮を撮影・記録する予定であったが、まずはグルコース刺激で洞房結節細胞の収縮パターンがどのように変化するのかを明らかにするため、変則性収縮パターンの詳細な検討を行った。次にLCRの空間分布を検討する予定であったが、グルコース刺激による変則性リズム形成の作用におけるミトコンドリア代謝の寄与を同時に検討するため、当初の計画をさらに発展させ、ミトコンドリアの空間分布とLCRの発生部位との位置関係を検討した。
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| Strategy for Future Research Activity |
①グルコース刺激による変則性リズム形成へのLCRの関与を解析 (令和2年度): Ca2+指示薬Calbryte520 AMを負荷したマウス単離洞房結節細胞のCa2+イメージングを行い、5 mMと20 mMグルコース存在下で惹起されるLCRおよびCa2+ transientの振幅、Ca2+ transientからLCR発生までの時間(LCR period)、Ca2+ transientの周期長(CL)を比較・検討する。
②LCRの制御破綻および変則性リズム形成を惹起するシグナル伝達系の解析およびミトコンドリア代謝の関与を検討 (令和2年度): 1) 20 mMグルコース負荷で惹起した変則性収縮およびLCR・Ca2+ transientの振幅、LCR period、CLの変化におけるEpac-Rap-PLC/IP3-PKC-CaMKIIの関与を、それぞれの阻害薬を用いて検討する。2) O-GlcNAcylationによるCaMKII活性化の関与を検討し、Epac-Rap-PLC/IP3-PKC-CaMKIIシグナル伝達系におけるO-GlcNAcylationの位置づけを明らかにする。3) Ca2+指示薬Mag-Fluo-4を用いて、グルコース刺激による筋小胞体のCa2+の変化を直接検討する。4)IP3Rの関与を検討する。5)ミトコンドリア代謝の関与をATP合成酵素や電子伝達系の阻害剤を用いて検討する。
③グルコース刺激による不変則性リズム形成メカニズムのシミュレーション解析 (令和3年度): マウス洞房結節細胞モデルを構築し①と②の実験データや文献を基にEpacシグナル伝達系を含むマウス洞房結節細胞モデルを完成させ、グルコース刺激で惹起されるLCRの変化および変則性リズムをコンピュータ上に再現させ、そのメカニズムを定量的・総合的に解明する。
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| Causes of Carryover |
本年度に予定していた、グルコース刺激のLCRおよびCa2+ transientに対する作用を検討するための実験を翌年度に実施することと変更したため、計上していた実験用動物、細胞単離試薬、蛍光標識試薬購入のための予算を次年度使用額として改めて計上する。当初の予定通り、令和2年度の予算として、Epac-Rap-PLC/IP3-PKC-CaMKII系におけるそれぞれの因子の阻害薬(ESI-09(Epac), U73122 (PLC, IP3), Ro-31-8220 (PKC), KN-93 (CaMKII))、やO-GlcNAcylation によるCaMKII の関与を検討するため試薬(O-GlcNAcylation の阻害薬diazo-5-oxonorleucineおよびO-GlcNAcを除去する酵素O-GlcNAcaseの阻害剤thiamet-Gを使用)、IP3Rの関与を検討するための阻害薬（2APB/Xestospongin)、Ca2+指示薬Mag-Fluo-4の費用を計上する。
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