2021 Fiscal Year Research-status Report
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19K07282
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| Research Institution | University of Fukui |
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Principal Investigator |
竹田 有加里 福井大学, 学術研究院医学系部門, 助教 (20582159)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 洞房結節細胞 / Ca2+制御異常 / シグナル伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
糖尿病患者は不整脈の発症率が高く、糖尿病患者の死亡率を著しく増加させている。その病因には高血糖による心筋細胞のCa2+ handling異常が関与すると示唆されているが、心自動能を司る洞房結節細胞のCa2+制御異常を検討した研究はない。申請者は、心自働能制御に関与するマウス洞房結節細胞の自発的かつ局所的なCa放出LCRの記録に成功した。本研究では高血糖によるLCR制御破綻を介する洞房結節由来の不整脈発症機序を定量的に解明することを目的とする。
令和元年度は、高グルコースの洞房結節細胞収縮リズム形成に対する作用を検討した。単離マウス洞房結節細胞に20 mMグルコース刺激を行った結果、収縮間隔が一過性に延長または短縮する変則的収縮が誘発された。本年度は、この作用について、CaMKIIが関与することを見いだした。
令和2年度は、高グルコースが洞房結節由来の不整脈発症に関与するか否か臓器レベルで検討するため、ランゲンドルフ灌流心に20 mMグルコースを灌流した。その結果、これまでに報告されている心室性の期外収縮とは別に、R-R間隔が一過性に延長または短縮する変則的リズムが誘発され、血糖グルコース濃度の上昇が洞房結節由来の不整脈発症に関与することを見いだした。本年度は、高グルコースの心リズムに対する作用を固体レベルで検討した。麻酔下でマウスに腹腔内のブドウ糖負荷試験（2g/kg）を行い、血糖とECGの同時記録を行った結果、グルコースの負荷で、血糖が20 mM (2型糖尿病dbdbマウスの平均血糖値)に上昇しても、心リズムに大きな変動はみられなかった。個体レベルでは、血糖上昇による不整脈発症に抑制作用が働いていると考えられる。さらに詳細に心臓リズムの変化についてPoincareプロットによる解析を行うため、半自動的な解析を実行するシステムを開発した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
高グルコースの洞房結節細胞収縮リズム形成に対する作用を検討するため、単離マウス洞房結節細胞に20 mMグルコース刺激を行った結果、収縮間隔が一過性に延長または短縮する変則的収縮が誘発された。この作用は、CaMKII阻害薬で消失するが、多くの細胞で自働能が消失すること、また、ベースの自働能にもCaMKIIが慣用することから、阻害薬を用いた検討は適切でないことが明らかとなった。今後は予定を変更し、CaMKIIによるRyRのリン酸化レベル(P-Ser2809)を免疫蛍光染色法を用いて検討することとする。
また、高グルコースの洞房結節由来の不整脈発症への関与を個体レベルで検討するため、麻酔下でマウスに腹腔内のブドウ糖負荷試験（2g/kg）を行い、血糖とECGの同時記録を行った。その結果、グルコースの負荷で、血糖が20 mM (2型糖尿病dbdbマウスの平均血糖値)に上昇しても、固体レベルは新リズムに大きな変動はみられなかった。この結果をより詳細に検討するため、当初の予定を変更して、心臓リズム変化のPoincareプロット解析を半自動的に実行することができるシステムを開発した。
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| Strategy for Future Research Activity |
グルコース刺激による変則性リズム形成へのLCRの関与を解析: Ca2+指示薬Calbryte520 AMを負荷したマウス単離洞房結節細胞のCa2+イメージングを行い、5 mMと20 mMグルコース存在下で惹起されるLCRおよびCa2+ transientの振幅、Ca2+ transientからLCR発生までの時間(LCR period)、Ca2+ transientの周期長(CL) を比較・検討する。
LCRの制御破綻および変則性リズム形成を惹起するシグナル伝達系の解析およびミトコンドリア代謝の関与を検討: 1) 20 mMグルコース負荷で惹起した変則性 収縮およびLCR・Ca2+ transientの振幅、LCR period、CLの変化におけるEpac-Rap-PLC/IP3-PKC-CaMKIIの関与を、それぞれの阻害薬を用いて検討する。2) OGlcNAcylationによるCaMKII活性化の関与を検討し、Epac-Rap-PLC/IP3-PKC-CaMKIIシグナル伝達系におけるO-GlcNAcylationの位置づけを明らかにする。3) CaMKIIによるRyRのリン酸化レベル(P-Ser2809)を免疫蛍光染色法を用いて検討する。4)IP3Rの関与を検討する。5)ミトコンドリア代謝の関与をATP合成酵 素や電子伝達系の阻害剤を用いて検討する。
高グルコースの洞房結節由来の不整脈発症への関与を検討：麻酔下でマウスに腹腔内のブドウ糖負荷試験（2g/kg）を行い、血糖とECGの同時記録を行う。心臓リズム変化のPoincareプロット解析を半自動的に実行することができるシステムを開発した。これを用いて、高グルコースの洞房結節由来の不整脈発症への関与を検討する。
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| Causes of Carryover |
令和3年度に予定していた、グルコース刺激のLCRおよびCa2+ transientに対する作用を検討するための実験を次年度に実施することと変更したため、計上していた実験用動物、細胞単離試薬、蛍光標識試薬購入のための予算を次年度使用額として改めて計上する。また、Epac-Rap-PLC/IP3-PKC-CaMKII系におけるそれぞれの因子の阻害薬(ESI-09(Epac), U73122 (PLC, IP3), Ro-31-8220 (PKC)やO-GlcNAcylation によるCaMKII の関与を検討するため試薬(O-GlcNAcylation の阻害薬diazo-5-oxonorleucineおよびO-GlcNAcを除去する酵素O-GlcNAcaseの阻害剤thiamet-Gを使用)、IP3Rの関与を検討するための阻害薬
（2APB/Xestospongin)、Ca2+指示薬Mag-Fluo-4の費用を計上する。
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Research Products
(1 results)
