2020 Fiscal Year Research-status Report
筋線維芽細胞の機能発現に焦点を当てた網膜変性疾患に対する創薬研究
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19K07351
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
林 謙一郎 大阪大学, 医学系研究科, 准教授 (90238105)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
木村 和博 山口大学, 大学院医学系研究科, 教授 (60335255)
中川 好秋 京都大学, 農学研究科, 准教授 (80155689)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 加齢黄斑変性 / 加齢黄斑変性 / 網膜色素上皮細胞 / 筋線維芽細胞 / 瘢痕 / 血管新生 / 血管内皮細胞 / Benzoylphenyl urea (BPU) |
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| Outline of Annual Research Achievements |
加齢黄斑変性 (AMD) は血管新生とその破綻に起因する網膜変性疾患で、高齢化の進行により患者の増加が予想される。AMD治療薬として抗VEGF剤が使用されるが、根治的な治癒には至らず病変部で瘢痕(線維性増殖組織) が形成される。瘢痕は炎症に伴う新生血管破綻により筋線維芽細胞に形質転換した網膜色素上皮細胞(RPE)の増殖・脈絡膜への浸潤・ECMの過剰産生により形成され、視覚障害を起こすが、瘢痕に対する有効な治療薬はない。筋線維芽細胞機能阻害に焦点を当てた２つのアプローチ（① MRTF機能阻害化合物の探索と② BPU類縁体、BPU17を創薬シードとした研究）から根治的AMD治療薬の創成が研究目的である。
新規MRTF結合タンパク質はMRTF/SRF/CArG-boxを介した転写制御に重要な役割を担うことを明らかにしている。また、BPU17は、モデル動物を用いた解析で瘢痕形成を抑制することと初代培養RPEを用いた解析で炎症性サイトカイン(TGF-β)により形質転換したRPE由来の筋線維芽細胞の機能発現を阻害することを明らかにしている。さらに、BPU17は血管新生をも抑制する知見を得ている（初代培養血管内皮細胞を用いた研究）。
2020年度の研究の概要を以下に記載する。
① に関しては新たなMRTF結合タンパク質の補助因子と MRTFとの結合が示唆されたため、この相互作用とその機能を検証した。
② に関してはBPU17による in vivoでの血管新生阻害の検証と初代培養微小血管内皮細胞を用いた血管新生阻害機構の解析を行った。この理由としてin vivoでの血管新生は既存の微小血管から血管枝が分岐して血管網を構築することが明らかにされているためである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上記の項目①及び②に分けて進歩状況を記載する。
① 新たなMRTF結合タンパク質、その補助因子及びSRFとMRTFとの相互作用をin vitroでのタンパク質間相互作用解析系で検証した。この結果、新たなMRTF結合タンパク質とSRF及びMRTFとの親和性は、補助因子の存在により増強することが判明した。この補助因子はMRTF/SRF/CArG-boxを介した転写を促進し（3xCArG-box-luciferaseをレポーター遺伝子としたpromoter assayによる解析）、MRTF及び新たなMRTF結合タンパク質のCArG-boxへの親和性を高めることを明らかにした（3xCArG-boxをprobeとしたin vitroタンパク質―DNA相互作用解析）。しかしながら、SRFとCArG-boxとの親和性には影響を及ぼすことは認められなかった。以上の解析から、新たなMRTF結合タンパク質及びその補助因子はMRTFのSRFに対する親和性を高める役割を担うことが明らかになった。
② モデル動物を用いて網膜瘢痕形成及び脈絡膜新生血管に対するBPU17の阻害効果の検証を行った。この結果、BPU17はin vivoにおいても網膜色素細胞の筋線維芽細胞への形質転換に起因する瘢痕形成と血管新生を阻害する効能を有することが明らかになった。また、初代培養微小血管内皮細胞を用いた血管新生阻害機構の解析から、昨年度の報告書に記載したヒト動脈由来の初代培養血管内皮細胞で解析と同様の結果を得た（血管内皮細胞におけるBPU17の標的はMRTF/SRF/CArG-boxを介した転写抑制に起因する）。さらに、細胞から放出された乳酸脱水素酵素（LDH）活性を指標にした細胞毒性の検証においても、BPU17は微小血管内皮細胞に対しても有意な細胞毒性を示さなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記の項目①及び②に分けて今後の推進方策を記載する。
① 具体的には以下の手法での検証を進めている。１）網膜瘢痕化マウスモデルの眼内へのsiRNAまたはshRNAを投与による新たなMRTF結合タンパク質の発現低下が瘢痕形成に及ぼす効果を検証する（病理組織解析や免疫組織染色及びRT－qPCRによる関連遺伝子の発現解析）。２）新たなMRTF結合タンパク質を欠損させたマウス（すでに海外の研究者により確立されており、凍結精子を供与してもらい体外受精により遺伝子欠損マウスを作成）での検証。このアプローチはすでに進行させている。
② すでに合成済みのBPU17類縁体の瘢痕形成・新生血管に対する効果をin vivo及び初代培養細胞を用いた解析により検証する。BPUは農薬として用いられており、その作用機序はキチン合成阻害であることはすでに明らかにされている。しかしながら、これまでの本研究結果からBPU17を含めたBPU類縁体は昆虫細胞においてもMRTF/SRF/CArG-boxを介した転写系を抑制し、アクチンや細胞接着因子の発現低下により細胞運動ならびに細胞増殖に障害を来たすことが示唆される。この推測が正しければ、BPUの農薬として新たな作用機序を見いだしたことになり、その生物学的意義は大きく、農薬化学の分野にもインパクトを与えると考えている。このため、昆虫（昆虫細胞）におけるキチン合成阻害以外の効能検証も予定している。
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| Causes of Carryover |
本研究の成果これまでに得た知見から論文投稿できる段階に達しつつあると考えている。①のプロジェクトに関して動物実験での解析を加えて論文にするのが望ましいが、時間がかかるため現時点までの知見をまとめて投稿する予定である（現時点で論文原稿はほぼ完成している）。②のプロジェクトに関しても論文原稿も大旨出来上がっているが、よりインパクトの高い論文にするためには更なる動物実験や薬物の安全性試験等の創薬に向けた解析結果が必要であると考えている。これらの解析および論文投稿には費用がかかるため、前年度の研究はできるだけ費用を節約して施行した。この結果、「次年度使用額(B-A)」欄が「0」より大きくなった。この繰り越した金額は前述した費用に当てる予定である。
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Research Products
(2 results)
