筋線維芽細胞の機能発現に焦点を当てた網膜変性疾患に対する創薬研究

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07351
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 林 謙一郎 大阪大学, 医学系研究科, 准教授 (90238105)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 木村 和博 山口大学, 大学院医学系研究科, 教授 (60335255) ; 中川 好秋 京都大学, 農学研究科, 研究員 (80155689)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 加齢黄斑変性 / 網膜変性疾患 / 網膜色素上皮細胞 / 筋線維芽細胞 / 瘢痕 / 血管新生 / 血管内皮細胞 / Benzoylphenyl urea

Outline of Annual Research Achievements

加齢黄斑変性 (AMD) は血管新生とその破綻に起因する網膜変性疾患で、高齢化の進行により患者の増加が予想される。AMD治療薬として抗VEGF剤が使用されるが、根治的な治癒には至らず病変部で瘢痕(線維性増殖組織) が形成される。瘢痕は炎症に伴う新生血管破綻により筋線維芽細胞に形質転換した網膜色素上皮細胞(RPE)の増殖・脈絡膜への浸潤・ECMの過剰産生により形成され、視覚障害を起こすが、瘢痕に対する有効な治療薬はない。筋線維芽細胞機能阻害に焦点を当てた２つのアプローチ（①MRTF機能阻害化合物の探索と② BPU類縁体、BPU17を創薬シードとした研究）から根治的AMD治療薬の創成が研究目的である。
①に関しては新規MRTF結合タンパク質がMRTF/SRF/CArG-boxを介した転写制御に重要な役割を担うことを明らかにし、３次元構造解析によりMRTFと結合する領域及びアミノ酸残基を同定した。②に関してはBPU17がモデル動物を用いた解析で瘢痕形成を抑制することと初代培養RPEを用いた解析で炎症性サイトカイン(TGF-β)により形質転換したRPE由来の筋線維芽細胞の機能発現を阻害することを明らかにしている。さらに、BPU17は血管新生をも抑制する知見を得ている（初代培養血管内皮細胞を用いた研究）。
2021年度の研究の概要を以下に記載する。
①に関しては、これまでに得たデータを論文にまとめ投稿中である。
②に関してはBPU17結合タンパク質を単離し、同定し、その機能解析を行った。これまでのデータを基にした論文を作成中。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

上記の項目①及び②に分けて進捗情況を記載する。
①に関しては新たなMRTF結合タンパク質、その補助因子及びSRFとMRTFとの相互作用をin vitroでのタンパク質間相互作用解析系で検証した。この結果、新たなMRTF結合タンパク質とSRF及びMRTFとの親和性は、補助因子により増強した。この補助因子はMRTF/SRF/CArG-boxを介した転写を促進し、MRTF及び新たなMRTF結合タンパク質のCArG-boxへの親和性を高めることを明らかにした。以上の解析から、新たなMRTF結合タンパク質及びその補助因子はMRTFのSRFに対する親和性を高めることが明らかになった。さらに、３次元構造解析によりMRTFと結合する領域及びアミノ酸残基を同定した。以上のデータを論文にまとめ、投稿中である。
②BPU17はin vivoにおいて網膜色素細胞の筋線維芽細胞への形質転換に起因する瘢痕形成と血管新生を阻害する効能を有する。また、初代培養網膜色素細胞の筋線維芽細胞への形質転換の検証や動脈由来の初代培養血管内皮細胞及び初代培養微小血管内皮細胞を用いた血管新生阻害機構の解析から、BPU17の標的はMRTF/SRF/CArG-boxを介した転写抑制に起因することを見出した。さらにFG-beadsにBPU17をカップリングさせたaffinity-beadsを用いて、BPU17結合タンパク質の単離に成功し、マススペクトルによりこのタンパク質を同定した。このタンパク質の機能解析を目的としてsiRNAを介したノックダウンを施行したところ、BPU17処理により網膜色素細胞の筋線維芽細胞への形質転換及び血管新生が抑制された。現在、これまで得たデータをまとめた論文作成中である。

Strategy for Future Research Activity

上記の項目①及び②に分けて今後の推進方策を記載する。
①　具体的には以下の手法での検証を進めている。１）網膜瘢痕化マウスモデルの眼内へのsiRNAまたはshRNAを投与による新たなMRTF結合タンパク質の発現低下が瘢痕形成に及ぼす効果を検証する（病理組織解析や免疫組織染色及びRT－qPCRによる関連遺伝子の発現解析）。２）新たなMRTF結合タンパク質を欠損させたマウス（すでに海外の研究者により確立されており、凍結精子を供与してもらい体外受精により遺伝子欠損マウスを作成）での検証。このアプローチはすでに進行させている。
②　BPUは農薬として用いられており、その作用機序はキチン合成阻害であることはすでに明らかにされている。しかしながら、これまでの本研究結果からBPU17を含めたBPU類縁体は昆虫細胞においてもMRTF/SRF/CArG-boxを介した転写系を抑制し、アクチンや細胞接着因子の発現低下により細胞運動ならびに細胞増殖に障害を来たすことが示唆される。この推測が正しければ、BPUの農薬として新たな作用機序を見いだしたことになり、その生物学的意義は大きく、農薬化学の分野にもインパクトを与える。このため、昆虫（昆虫細胞）におけるキチン合成阻害以外の作用機序を検証し、推測を裏付ける結果を得た。現在、BPU結合タンパク質の同定し、この新たな作用機序の解明を目指している。

Causes of Carryover

本研究の成果これまでに得た知見から論文投稿できる段階に達しつつあると考えている。①のプロジェクトに関して動物実験での解析を加えて論文にするのが望ましいが、時間がかかるため現時点までの知見をまとめて投稿した。論文投稿経費を捻出するため、前年度の研究はできるだけ費用を節約して施行した。この結果、「次年度使用額(B-A)」欄が「0」より大きくなった。この繰り越した金額は論文投稿費用に当てる。