去勢抵抗性前立腺癌に対する新規免疫療法の確立に目指した腫瘍免疫機構の解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07486
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 高橋 智 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (60254281)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 内木 綾 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (20509236) ; 加藤 寛之 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (80791293)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 去勢抵抗性前立腺癌

Outline of Annual Research Achievements

(1) PLS10由来のcDNA発現ライブラリーの作成
PLS10のmRNAから逆転写によりcDNA群を作成し、エントリーベクターに組み込んだcDNAライブラリーを樹立した。さらにレンチウイルスベクターに組み替えたcDNA発現ライブラリーを作成した。cDNA発現ライブラリーが適切に作成されたかどうかを検討したところ、cDNAをエントリーベクターに組み込む段階での組み替え効率は23%程度、レンチウイルスベクターに組み替える段階での効率が33%程度であることを確認した。組み替え効率が低く、適切なcDNA発現ライブラリーが作成されていないことが明らかとなった。
(2) マイクロアレイ解析から抽出した遺伝子群の検討
PLS10、PLS20、PLS30のマイクロアレイ解析からPLS10のみ高発現がみられた9遺伝子（Cd81、Ccl2、Cx3cl1、Ifi44、Pycard、Nradd、Tmem9、Ubxd8、Tmem252）を抽出し、qRT-PCR法を用いてその発現を検討したところ、Cd81、Ccl2、Cx3cl1、Nradd、Tmem252の5遺伝子はmRNA量がPLS10のみ増加していることを確認した。この5遺伝子の中からCd81についてさらに検討した。PLS10、PLS30のCd81タンパク発現量を比較し、PLS10のみで高発現していることを確かめた。
これらを踏まえ、PCR法によりFLAG-Cd81融合遺伝子を構築し、Cd81発現レンチウイルスベクターを作成した。その後、PLS30に遺伝子導入を行い、PLS30にFLAG-Cd81が発現していることを確認した。Cd81を導入したPLS30は有意に細胞増殖速度が増加していた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

正常免疫を有するラットにおいても生着可能なPLS10細胞からmRNAを抽出し、そのcDNA群をエントリーベクターに組み込みcDNAライブラリーを作成した。さらにcDNAライブラリーをレンチウイルスベクターに組み替え、cDNA発現ライブラリーを作成した。精製mRNAをエントリーベクターに組み込む段階での組換え効率が23%程度、エントリーベクターからレンチウイルスベクターに組み替える段階での組換え効率が33%程度であったと考えられ、適切なcDNA発現ライブラリーが作成されていないことが明らかとなった。
PLS10、PLS20、PLS30のマイクロアレイ解析からPLS10のみで高発現がみられた遺伝子を9種類（Cd81、Ccl2、Cx3cl1、Ifi44、Pycard、Nradd、Tmem9、Ubxd8、Tmem252）見いだし、qRT-PCRにより５遺伝子でアレイ結果と合致することを確認した。その中でCd81についてはタンパクレベルにおいてPLS10で高発現し、Flowcytometryにより細胞膜でのCd81発現量が高発現していることを明らかにした。その後、FLAG-Cd81発現ベクターを作成し、正常免疫を有するラットでは生着しないPLS30細胞に導入した。FlowcytometryによりPLS30細胞表面にCd81が発現していることを確認した。また、ラット前立腺への移植実験のため、PLS30にルシフェリンを導入した上でさらにFLAG-Cd81を導入した細胞株を作成した。ルシフェリンにより発光することを確かめ、細胞表面にCd81が発現していることを確認した。CD81を導入したPLS30の細胞増殖能を検討した。WST-1を用いて継代48時間後のcell viabilityを比較したところ、Cd81を導入したPLS30は有意に細胞増殖速度が増加していた。

Strategy for Future Research Activity

(1) PLS10由来のcDNA発現ライブラリー作成の再検討
遺伝子発現ライブラリー作成にはGATEWAYシステムを用いているが、遺伝子組み換え効率を向上させるために、ベクター組み換えのためのLR Clonase反応時間の調節およびmRNAからcDNA作成時における温度、時間についても検討する。組み換え効率が50%以上に向上したcDNA発現ライブラリーを樹立できた場合には、これをPLS30に遺伝子導入し、PLS10 cDNAライブラリー発現PLS30細胞をラット腹葉前立腺に同種同所移植して腫瘍形成の有無について検討していく。腫瘍形成が見られた場合には、生着した腫瘍細胞から導入遺伝子を抽出して、免疫回避に関わる遺伝子の特定を行うと同時に細胞株の樹立を試み、その細胞特性を解析する。
(2) マイクロアレイ解析から抽出した遺伝子群の検討
Cd81を遺伝子導入して安定発現しているPLS30をラット腹葉前立腺に同種同所移植し、腫瘍形成されるか検討すると同時に、さらなる候補遺伝子（Ccl2、Cx3cl1、Nradd、Tmem252、Pycard）について順次発現ベクターを作成し、正常免疫ラットに移植して腫瘍形成能の検討を進めていく。また、cell cycle assayやinvasion assayを行い、in vitroにおける形質転換の有無を検討する。

Causes of Carryover

新型コロナウイルス感染症による緊急事態宣言およびその後のまん延防止等重点措置等により、当大学動物実験センターにおいて動物実験を始めることが困難となりました。そのために動物実験は次年度に繰越し、繰り越した金額をそれに充当する予定です。

Research Products

• [Journal Article] DPYD, down-regulated by the potentially chemopreventive agent luteolin, interacts with STAT3 in pancreatic cancer (2021)
  • Author(s): Kato H, Naiki-Ito A, Suzuki S, Inaguma S, Komura M, Nakao K, Naiki T, Kachi K, Kato A, Matsuo Y, Takahashi S.
  • Journal Title: Carcinogenesis Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1093/carcin/bgab017
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Cancer-Specific Targeting of Taurine-Upregulated Gene 1 Enhances the Effects of Chemotherapy in Pancreatic Cancer (2021)
  • Author(s): Tasaki Y, Suzuki M, Katsushima K, Shinjo K, Iijima K, Murofushi Y, Naiki-Ito A, Hayashi K, Qiu C, Takahashi A, Tanaka Y, Kawaguchi T, Sugawara M, Kataoka T, Naito M, Miyata K, Kataoka K, Noda T, Gao W, Kataoka H, Takahashi S, Kimura K, Kondo Y.
  • Journal Title: Cancer Research Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-20-3021
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] PBK expression predicts favorable survival in colorectal cancer patients (2021)
  • Author(s): Nagano-Matsuo A, Inoue S, Koshino A, Ota A, Nakao K, Komura M, Kato H, Naiki-Ito A, Watanabe K, Nagayasu Y, Hosokawa Y, Takiguchi S, Kasugai K, Kasai K, Inaguma S, Takahashi S
  • Journal Title: Virchows Archiv Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1007/s00428-021-03062-0
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Expression and Prognostic Significance of CD47-SIRPA Macrophage Checkpoint Molecules in Colorectal Cancer (2021)
  • Author(s): Sugimura-Nagata A, Koshino A, Inoue S, Matsuo-Nagano A, Komura M, Riku M, Ito H, Inoko A, Murakami H, Ebi M, Ogasawara N, Tsuzuki T, Takahashi S, Kasugai K, Kasai K, Inaguma S
  • Journal Title: International Journal of Molecular Science Volume: 22 Pages: -
  • DOI: 10.3390/ijms22052690
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Low RAI2 expression is a marker of poor prognosis in breast cancer (2021)
  • Author(s): Nishikawa S, Uemoto Y, Kim TS, Hisada T, Kondo N, Wanifuchi-Endo Y, Fujita T, Asano T, Katagiri Y, Terada M, Kato A, Dong Y, Sugiura H, Okuda K, Kato H, Osaga S, Takahashi S, Toyama T.
  • Journal Title: Breast Cancer Research and Treatment Volume: 187 Pages: 81-93
  • DOI: 10.1007/s10549-021-06176-w
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cell proliferation of rat bladder urothelium induced by nicotine is suppressed by the NADPH oxidase inhibitor, apocynin (2021)
  • Author(s): Suzuki S, Cohen SM, Arnold LL, Pennington KL, Gi M, Kato H, Naiki T, Naiki-Ito A, Wanibuchi H, Takahashi S.
  • Journal Title: Toxicology Letters Volume: 336 Pages: 32-38
  • DOI: 10.1016/j.toxlet.2020.11.005
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Role of γ-H2AX as a biomarker for detection of bladder carcinogens in F344 rats (2020)
  • Author(s): Suzuki S, Gi M, Toyoda T, Kato H, Naiki-Ito A, Kakehashi A, Ogawa K, Takahashi S, Wanibuchi H.
  • Journal Title: Journal of Toxicologic Pathology Volume: 33 Pages: 279-285
  • DOI: 10.1293/tox.2020-0038
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Comparative carcinogenicity study of a thick, straight-type and a thin, tangled-type multi-walled carbon nanotube administered by intra-tracheal instillation in the rat (2020)
  • Author(s): Saleh DM, Alexander WT, Numano T, Ahmed OHM, Gunasekaran S, Alexander DB, Abdelgied M, El-Gazzar AM, Takase H, Xu J, Naiki-Ito A, Takahashi S, Hirose A, Ohnishi M, Kanno J, Tsuda H.
  • Journal Title: Particle and Fibre Toxicology Volume: 17 Pages: -
  • DOI: 10.1186/s12989-020-00382-y.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] The phosphodiesterase 5 inhibitor tadalafil has renoprotective effects in a rat model of chronic kidney disease (2020)
  • Author(s): Tomita N, Hotta Y, Naiki-Ito A, Hirano K, Kataoka T, Maeda Y, Takahashi S, Kimura K.
  • Journal Title: Physiological reports Volume: 8 Pages: -
  • DOI: 10.14814/phy2.14556
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Sentinel lymph node biopsy may be unnecessary for ductal carcinoma in situ of the breast that is small and diagnosed by preoperative biopsy (2020)
  • Author(s): Uemoto Y, Kondo N, Wanifuchi-Endo Y, Asano T, Hisada T, Nishikawa S, Katagiri Y, Terada M, Kato A, Okuda K, Sugiura H, Kato H, Takahashi S, Toyama T.
  • Journal Title: Japanese Journal of Clinical Oncology Volume: 50 Pages: 1364-1369
  • DOI: 10.1093/jjco/hyaa151
• [Journal Article] A novel model of non-alcoholic steatohepatitis with fibrosis and carcinogenesis in connexin 32 dominant-negative transgenic rats (2020)
  • Author(s): Naiki-Ito A, Kato H, Naiki T, Yeewa R, Aoyama Y, Nagayasu Y, Suzuki S, Inaguma S, Takahashi S.
  • Journal Title: Archives of Toxicology Volume: 94 Pages: 4085-4097
  • DOI: 10.1007/s00204-020-02873-5
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The standard form of CD44 as a marker for invasion of encapsulated papillary carcinoma of the breast (2020)
  • Author(s): Kato H, Naiki-Ito A, Yamada T, Suzuki S, Yamashita Y, Inaguma S, Kondo N, Wanifuchi-Endo Y, Toyama T, Takahashi S.
  • Journal Title: Pathology International Volume: 70 Pages: 835-843
  • DOI: 10.1111/pin.13001
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Anagliptin, a dipeptidyl peptidase-4 inhibitor, improved bladder function and hemodynamics in rats with bilateral internal iliac artery ligation (2020)
  • Author(s): Hotta Y, Takahashi S, Tokoro M, Naiki-Ito A, Maeda K, Kawata R, Kataoka T, Ohta Y, Hamakawa T, Takahashi S, Yasui T, Kimura K.
  • Journal Title: Neurourology and Urodynamics Volume: 39 Pages: 1922-1929
  • DOI: 10.1002/nau.24449
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, NCL1, could cause testicular toxicity via the regulation of apoptosis (2020)
  • Author(s): Nozaki S, Naiki T, Naiki-Ito A, Iwatsuki S, Takeda T, Etani T, Nagai T, Iida K, Kato H, Suzuki T, Takahashi S, Umemoto Y, Yasui T.
  • Journal Title: Andrology Volume: 8 Pages: 1895-1906
  • DOI: 10.1111/andr.12846
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Dehydrozingerone, a Curcumin Analog, as a Potential Anti-Prostate Cancer Inhibitor In Vitro and In Vivo (2020)
  • Author(s): Mapoung S, Suzuki S, Fuji S, Naiki-Ito A, Kato H, Yodkeeree S, Sakorn N, Ovatlarnporn C, Takahashi S, Limtrakul Dejkriengkraikul P.
  • Journal Title: Molecules Volume: 25 Pages: -
  • DOI: 10.3390/molecules25122737
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] A novel sensitive detection method for DNA methylation in circulating free DNA of pancreatic cancer (2020)
  • Author(s): Shinjo K, Hara K, Nagae G, Umeda T, Katsushima K, Suzuki M, Murofushi Y, Umezu Y, Takeuchi I, Takahashi S, Okuno Y, Matsuo K, Ito H, Tajima S, Aburatani H, Yamao K, Kondo Y.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 15 Pages: -
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0233782
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Omental adipocytes promote peritoneal metastasis of gastric cancer through the CXCL2-VEGFA axis (2020)
  • Author(s): Natsume M, Shimura T, Iwasaki H, Okuda Y, Hayashi K, Takahashi S, Kataoka H.
  • Journal Title: British Journal of Cancer Volume: 123 Pages: 459-470
  • DOI: 10.1038/s41416-020-0898-3
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Comparison of Real-Time Virtual Sonography Navigation Versus BioJet Navigation on Magnetic Resonance Imaging-Guided Prostate Needle Biopsy: A Single Institutional Analysis (2020)
  • Author(s): Nagai T, Naiki T, Hamamoto S, Etani T, Naiki-Ito A, Nakagawa M, Iida K, Iwatsuki S, Taguchi K, Maruyama T, Kawai N, Takahashi S, Yasui T.
  • Journal Title: Jouranl of Endourology Volume: 34 Pages: 739-745
  • DOI: 10.1089/end.2020.0042
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Luteolin suppresses bladder cancer growth via regulation of mechanistic target of rapamycin pathway (2020)
  • Author(s): Iida K, Naiki T, Naiki-Ito A, Suzuki S, Kato H, Nozaki S, Nagai T, Etani T, Nagayasu Y, Ando R, Kawai N, Yasui T, Takahashi S.
  • Journal Title: Cancer Science Volume: 111 Pages: 1165-1179
  • DOI: 10.1111/cas.14334
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] エラグ酸の膵発癌抑制効果と膵癌におけるレジスチンの効果の検討 (2021)
  • Author(s): 加藤寛之、内木綾、小村理行、髙橋智
  • Organizer: 第37回日本毒性病理学会総会および学術集会
• [Presentation] LuteolinはmTORシグナルとp21発現の制御により膀胱発がんを抑制する (2021)
  • Author(s): 内木綾、加藤寛之、小村理行、髙橋智
  • Organizer: 第37回日本毒性病理学会総会および学術集会
• [Presentation] NADPH oxidase阻害剤apocyninによるニコチン誘発膀胱増殖性病変抑制効果 (2021)
  • Author(s): 鈴木周五、加藤寛之、内木綾、魏民、鰐渕英機、髙橋智
  • Organizer: 第37回日本毒性病理学会総会および学術集会
• [Presentation] CD70分子はMET-ERK経路の活性化、腫瘍細胞の免疫逃避亢進により悪性 胸膜中皮腫患者の予後を悪化させる (2020)
  • Author(s): 稲熊 真悟、Jerzy Lasota、池田 洋、笠井 謙次、 Markku Miettinen、高橋 智
  • Organizer: 第109回日本病理学会総会
• [Presentation] NADPH oxidase阻害剤apocyninによるニコチン誘発ラット膀胱増殖性病 変抑制効果 (2020)
  • Author(s): 鈴木 周五、加藤 寛之、内木 綾、鰐渕 英機、高橋 智
  • Organizer: 第109回日本病理学会総会
• [Presentation] LuteolinはSTAT3経路とDPD発現を低下させ膵発癌を抑制する (2020)
  • Author(s): 加藤 寛之、内木 綾、鈴木 周五、山下 依子、稲熊 真悟、 高橋 智
  • Organizer: 第109回日本病理学会総会
• [Presentation] 大腸癌細胞におけるPBK発現は大腸癌患者の予後良好因子である (2020)
  • Author(s): 中尾 健寿、稲熊 真悟、内木 綾、笠井 謙次、高橋 智
  • Organizer: 第109回日本病理学会総会
• [Presentation] MiR-8080はandrogen receptorスプライスバリアントの発現低下により 去勢抵抗性前立腺癌を抑制する (2020)
  • Author(s): 内木 綾、加藤 寛之、稲熊 真悟、山下 依子、高橋 智
  • Organizer: 第109回日本病理学会総会
• [Presentation] 前立腺癌に肺高血圧症を合併し死亡した一剖検例 (2020)
  • Author(s): 小村 理行、内木 綾、稲熊 真悟、高橋 智
  • Organizer: 第109回日本病理学会総会
• [Presentation] 脾臓sclerosing angiomatoid nodular transformation(SANT)の2例 (2020)
  • Author(s): 小林 瑞穂、加藤 寛之、稲熊 真悟、内木 綾、高橋 智
  • Organizer: 第109回日本病理学会総会
• [Presentation] ルテオリンはmTORシグナルとp21発現の制御により膀胱発がんを抑制する (2020)
  • Author(s): 内木綾、加藤寛之、小村理行、高橋智
  • Organizer: がん予防学術大会2020米子
• [Presentation] ラット膀胱尿路上皮のニコチンによる増殖はNADPH oxidase阻害剤apocyninにより抑制される (2020)
  • Author(s): 鈴木周五、加藤寛之、内木綾、魏民、鰐渕英機、高橋智
  • Organizer: 第79回日本癌学会学術総会
• [Presentation] CD70分子はMET-ERK経路の活性化、腫瘍細胞の免疫逃避亢進により悪性胸膜中皮腫患者の予後を悪化させる (2020)
  • Author(s): 稲熊真悟、Lasota Jerzy 、池田洋、笠井謙次、Miettinen Markku、高橋智
  • Organizer: 第79回日本癌学会学術総会
• [Presentation] Anti-Cancer Properties of Houttuynia cordata and Piper ribesioides on Breast Cancer Cells (2020)
  • Author(s): Subhawa Subhawat、内木綾、Chewonarin Teera、髙橋智、Banjerdpongchai Ratana
  • Organizer: 第79回日本癌学会学術総会
• [Presentation] Comparative study of anti-prostate cancer activity between hydrophilic and lipophilic extract from purple rice (2020)
  • Author(s): Yeewa Ranchana、内木綾、Kiriya Chanarat、Sakuludomkan Wannachai、Khanaree Chakkrit、髙橋智、Chewonarin Teera
  • Organizer: 第79回日本癌学会学術総会
• [Presentation] ハムスター膵発癌モデルにおけるエラグ酸の膵癌化学予防効果の検討 (2020)
  • Author(s): 加藤寛之、内木綾、小村理行、稲熊真悟、髙橋智
  • Organizer: 第79回日本癌学会学術総会
• [Presentation] 抗酸化物質ルテオリンを用いたがん予防 (2020)
  • Author(s): 内木綾、加藤寛之、内木拓、髙橋智
  • Organizer: 第79回日本癌学会学術総会
• [Presentation] SMARCA4欠損未分化癌の一例 (2020)
  • Author(s): 中尾健寿、小林瑞穂、稲熊真悟、内木綾、加藤寛之、髙橋智
  • Organizer: 第66回日本病理学会秋期特別総会
• [Presentation] 羊水塞栓症の一剖検例 (2020)
  • Author(s): 小林瑞穂、髙橋智、田尻佐和子
  • Organizer: 第66回日本病理学会秋期特別総会