2019 Fiscal Year Research-status Report
新たな百日咳ワクチンの開発に向けて-外膜ベシクルと宿主細胞の相互作用
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19K07561
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| Research Institution | Kyorin University |
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Principal Investigator |
花輪 智子 杏林大学, 医学部, 教授 (80255405)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
阿部 章夫 北里大学, 感染制御科学府, 教授 (50184205)
桑江 朝臣 北里大学, 感染制御科学府, 准教授 (60337996)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 百日咳菌 / ベシクル / OMV / ワクチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
百日咳は百日咳菌による急性気道感染症であり、日本を含む先進国では予防のため無細胞ワクチンの接種が行われている。しかし現行のワクチンは発症を抑制しても感染を防御できず、国内の患者報告数は年間1万人を超えていることから新規ワクチンの開発が望まれている。
外膜ベシクル（OMV: outer membrane vesicle）は細菌由来のタンパク質、DNAなどが外膜成分により包まれた直径30-250 nmの小胞であり、グラム陰性菌により分泌される。病原細菌の分泌するOMVにはしばしば病原因子が含まれており、病原性発現に関わっていると考えられている。百日咳においてもOMVをワクチンに用いるための研究が行われているが、これらは超音波処理により放出されるものであり細菌独自の機構により分泌されるものではない。そこで様々な由来のOMVに含まれるタンパク質を解析し、百日咳菌の病原性発現におけるOMVの病原性における役割を検討する。宿主内において細菌のおかれている環境は多様であり、それぞれの環境因子に応答して病原性の発現を調節していると考えられている。本課題では、百日咳菌が宿主内微小環境に応答して種々のOMVを分泌しそれらが異なる役割を担うことで病原性を制御しているという仮説の下、細胞表層ストレス応答およびペリクルに由来するOMVの特徴および宿主細胞との相互作用を解析する。本研究の成果は、百日咳菌の定着や病原性発現の制御機構を理解に繋がり新規ワクチン開発の端緒となる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
百日咳菌のペリクル由来OMVは振とう培養した菌由来のOMVと含有タンパク質の種類および密度が異なる。そこでそれぞれのOMVの性状を詳細に解析している。
百日咳菌の臨床分離株およびワクチン株の培養液を遠心分離、ろ過して細菌細胞を除去し、超遠心分離またはExoBacteria OMV isolation Kit (System Biosciences 社製)を用いてOMVを調製した。それを用いてSDS-PAGEにより解析した結果、タンパク質のプロファイルに一部違いがみられたため、主要なバンドについて解析を進めている。
細胞表層ストレス応答はRNAポリメラーゼσサブユニットであるRpoEが担うため、anit-RpoEであるRseAを欠損させるとRpoEは常に活性化する。このrseA変異株を振とう培養し、細胞表層ストレス由来のOMVを調製した。変異株に含まれるOMVのタンパク質は親株と顕著な違いがみられなかったが、その産生量が多い傾向が認められた。一方、OMVの密度はOptiPrepを用いた密度勾配遠心法、粒子径はゼータサイザーにより測定した結果、バイオフィルム由来のOMVの粒子径は、浮遊菌由来のものより大きい傾向がみられた。含有タンパク質の解析では、OMVに含まれるタンパク質をSDS-PAGEおよびイムノブロッティング解析したところ、そのパターンに違いがみとめられたため、プロテオーム解析を行った。その結果、補体不活化因子であるVag8、BrkAなどはいずれのOMVにも含まれていたが、赤血球凝集素、アデニレートシクラーゼ毒素など定着に関わる病原因子がバイオフィルム由来のOMV有意に多く含まれていた。一方、浮遊菌由来のOMVにはバイオフィルム由来OMVより多種のタンパク質が含まれていた。現在含まれていた病原因子の生物活性などを調べている。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまで明らかとなったバイオフィルム由来OMVに含まれる定着に関わる病原因子の生物活性および局在を明らかにし、百日咳菌病原性発現における役割を推察する。また、OMVに含まれる病原因子の活性を測定する。さらに各病原因子に対する抗体を用いて蛍光顕微鏡または免疫電子顕微鏡により局在を解析する。これらの方法により検出が困難な場合、病原因子タンパク質とGFPの融合タンパク質を用いる方法も検討する。
また、OMVとマクロファージおよび上皮細胞との相互作用を検討し、百日咳菌の病原性におけるOMVの役割を明らかにする。ヒト肺胞上皮細胞株A549またはJ774.1などのマクロファージ細胞株に、蛍光標識したOMVを添加し、形態の変化、培養上清中の産生されるIL-1b、IL-6、IL-8などのサイトカイン産生量および菌の付着能や貪食能を測定する。また、OMVの細胞への取り込みを蛍光顕微鏡により観察し、OMVと細胞の相互作用を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
研究の効率化を鑑みて行う実験の順序を入れ換え、2020年度に組み込むこととしたことで、それにかかる試薬の金額に差がでたため。
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