2020 Fiscal Year Research-status Report
新たな百日咳ワクチンの開発に向けて-外膜ベシクルと宿主細胞の相互作用
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19K07561
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| Research Institution | Kyorin University |
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Principal Investigator |
花輪 智子 杏林大学, 医学部, 教授 (80255405)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
阿部 章夫 北里大学, 感染制御科学府, 教授 (50184205)
桑江 朝臣 北里大学, 感染制御科学府, 准教授 (60337996)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | OMV / 百日咳菌 / ワクチン / バイオフィルム / 病原因子 / FHA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
外膜ベシクル（OMV）は細菌由来のタンパク質、DNA、RNAなどが外膜成分により包まれた直径30-250 nmの小胞であり、グラム陰性菌により分泌される。近年では細菌のもつ分泌系の一つとして捉えられてきており、細菌間および宿主細胞に細菌由来の因子を運搬し、様々な生理機能や病原性の発現に重要な役割を担っていると考えられている。
病原細菌の放出するOMVにはしばしば病原因子が含まれており、免疫原性があることから。百日咳菌の分泌するOMVも新たなワクチンとして注目されている。一方、百日咳菌のOMVの病原性における役割は明らかにされていない。
現在、百日咳ワクチンとして解析されているOMVは超音波処理により放出されるものであり、細菌独自の機構により分泌されるものではない。そこで菌が保有する機構により分泌されるOMVについて、由来の異なるOMVを用いて、含有されている病原因子とその生物活性を明らかにする。
細菌は急性期に発現している病原因子と慢性期に産生する病原因子の種類は異なる。現在、慢性化する咳症状を呈する成人の感染症の中には百日咳菌感染症が一定数含まれていることが知られている。百日咳菌の定着を抑制するワクチンの開発と評価には、その定着機構の解析が重要となる。そこで本課題では、急性期に放出されるOMVとして浮遊細菌から放出されるOMVと慢性疾患と深く関わっているバイオフィルムから放出されるOMVに着目して研究を進めている。
これらのOMVに含まれる病原因子を明らかにし、さらに宿主細胞との相互作用を検討することで、ことで百日咳菌の病原性発現におけるOMVの役割を検討する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
新型コロナウイルス感染拡大に対する措置のため、共通機器の使用制限、共同研究者の施設への移動制限などにより当初の計画よりやや遅れている。
前年度までに百日咳菌の放出するOMVの調製方法の検討、粒子系および密度などの物理性状、含有タンパク質のプロテオーム解析を行った。2020年度にはさらにカラムを用いたOMVの調製法の検討および細胞との相互作用を調べるため肺胞上皮細胞株であるA549およびマウス由来のマクロファージ細胞株J77４に添加し、その形態変化の観察、さらに実験条件を設定する目的でFHAの抗体を用いてL2細胞に百日咳菌を添加し、蛍光免疫染色を行った。
カラムを用いた精製法については、超遠心法およびOptiPrepを用いた密度勾配遠心法により精製したOMVの含有タンパク質および脂質量と比較した。その結果、超遠心法で精製したOMVに比べ、タンパク質に対する脂質含有量が低いこと、検出されるタンパク質の種類が多数検出されたことから、カラム法による精製は純度が低く、今後の検討に不向きであると判定した。
A549にOMVを添加したところ、細胞の伸長およびクラスタリングが観察された。これはバイオフィルム由来と浮遊細菌由来のOMVと両者に観察された。また、J774にOMVを添加した場合、細胞の変形と付着している細胞の減少が観察された。
蛍光免疫染色は、使用できる抗体の選別を行った。代表者および分担者らはこれまでの研究において、主要な病原因子であり付着および免疫修飾作用が報告されているFHAに対する抗体を複数作成、保有している。その中から蛍光染色に最も適したFHA抗体を選出するため、L2細胞に百日咳菌を感染させ、それぞれの抗体を用いて蛍光染色を行った。その結果、最もシグナルが強く、特異的に反応する抗体について、今後の実験に用いることを決定した。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度までにOMVの物理学的、生化学的性状の解析を終了し、精製方法も確立した。そこで、今年度は宿主細胞との相互作用を中心に解析を行う。
前年度までの結果から、バイオフィルム由来のOMVにはFHAが豊富に含まれていることが明らかとなり、これが本菌の定着および病態遷延化に影響を及ぼしている可能性を考え、FHAの生物活性を中心に解析する。また、これまでアデニレートサイクラ－ゼ毒素（ACT）についてもバイオフィルム由来のOMVに安定化して含まれていることを明らかにしている。ACTは主要な病原因子の一つである。これまでACT分子が直接宿主細胞に取り込まれるという報告があるが、OMVに安定化して含まれていることからOMVを介して宿主細胞に運搬される可能性が考えられる。
これらのことから、OMVに含まれるACTおよびFHAがOMVを介して宿主細胞に運搬される可能性を免疫蛍光染色の手法により検討する。
さらにOMV添加により細胞に変化がみられた前年度の結果から、これらの変化を定量化するため、生存する細胞数をLDH活性の定量、ファロイジンを用いたアクチンフィラメントの蛍光染色、産生されるIL-6、IL-1量の定量などを実施し、OMV添加による細胞応答を解析する。
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| Causes of Carryover |
コロナウイルス感染拡大による影響から国際学会への参加を中止したため旅費の支出がなくなった。また、輸入品の試薬入荷が滞っていたことで昨年度分の使用額が変更となった。試薬は購入時期を４月以降に変更し、開催される国際学会にはZoomで参加する。
当初予定していた前年度の実験の一部を2021年度に試薬を入手でき次第遂行する。研究成果を発表する機会として、国際学会には当初予定していた学会に加えて欧州感染症学会でZoom参加して発表する。
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