2020 Fiscal Year Research-status Report
Formation mechanism and eradication technology of energy-accumulaed persisters
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19K07565
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| Research Institution | Waseda University |
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Principal Investigator |
常田 聡 早稲田大学, 理工学術院, 教授 (30281645)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | persister / エネルギー代謝 / ATP / 乳酸デヒドロゲナーゼ / SOS応答 / 抗菌薬抵抗性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、細菌感染症の慢性化や再発の原因の一つとして、非遺伝的に抗菌薬から生き残るpersisterという表現型が注目されている。persisterは薬剤耐性菌形成の温床になるため、persisterを効率よく根絶させることが重要な課題となっている。従来、persisterはエネルギー代謝が枯渇した状態にあることが一般的であるとされていたが、本研究室の先行研究により、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ldhA）を過剰発現した大腸菌は、エネルギー代謝が増加することによって抗菌薬に対する抵抗性を高める新たなタイプのpersisterであることが示唆された。本研究ではエネルギー代謝を介したldhA発現によるpersister形成のメカニズムを明らかにすることを目的とした。
令和元年度の研究において、ldhA過剰発現株でSOS応答制御遺伝子recAの発現量が有意に増加することがわかったことを受け、令和2年度は、モデル微生物である大腸菌のrecA欠損株およびrecA欠損+ldhA過剰発現株を用い、抗菌薬処理後の生存率を比較した。その結果、recA欠損株と比較してrecA欠損+ldhA過剰発現株のpersisterの増加は見られなかった。したがって、recA遺伝子はldhA発現の下流でpersister形成に関与することが示唆された。次に、遺伝子損傷時に産生することが知られているヒドロキシラジカル量をフローサイトメーターで測定した。その結果、ldhA過剰発現株において抗菌薬処理後のヒドロキシラジカルの産生量が抑制されていることが示された。以上の結果から、ldhAが発現するとrecA発現を活性化させることでDNA修復応答を誘導し生存に寄与する一方、ヒドロキシラジカル産生を抑制することでDNA損傷を抑制していることが推察された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では臨床的に意義のある臨床分離株を海外の研究機関から取り寄せて研究に使用することを予定していたが、新型コロナウイルス感染拡大の影響を受け、取り寄せることができなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）モデル微生物として大腸菌を用い、ldhA発現を起点としたSOS応答による遺伝子修復機構を介してpersisterが形成されるメカニズムを引き続き検証する。ldhA発現時に前もってSOS応答を介した遺伝子修復機構を活性化させることで将来的な抗菌薬ストレスの際に再増殖可能なpersisterが誘導されているという仮説の下で検証を行う。まず、抗菌薬除去後の再増殖活性を調べるため、抗菌薬処理したldhA過剰発現株のコロニーサイズを野生株と比較する。また、抗菌薬とともにSOS応答阻害剤を加えることで抗菌薬処理後のコロニーサイズや生存率がどのように変化するかを評価する。
２）臨床分離株を海外の研究機関から取り寄せる計画は中止し、モデル微生物である大腸菌の野生株およびldhA過剰発現株を用い、ATP濃度に応じて蛍光色が変化するタンパク質QUEENの遺伝子を導入する。フローサイトメトリーおよびマイクロ流体デバイス内でATPレベルを経時的に測定し、ldhA発現に伴うATPレベルの変化を観察する。また、セルソーターを用いてATPレベルが高い細胞集団と低い細胞集団を分取し、それらの集団における抗菌薬抵抗性を比較する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染拡大の影響により、海外からの臨床分離株取り寄せが中止となり、実験計画が一部変更になったため、次年度使用額が生じた。次年度は、実験計画を一部変更し、すでに構築したldhA過剰発現大腸菌に加え、ATP濃度に応じて蛍光色が変化するタンパク質QUEENの遺伝子を導入した遺伝子組換え株を作製し、研究を加速させることを予定している。今回生じた次年度使用額と翌年度分として請求した助成金をそれらの遺伝子組換え実験の費用に充てる。
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