2019 Fiscal Year Research-status Report
B型肝炎ウイルスの細胞内侵入メカニズムの解明と侵入阻害剤開発への応用
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19K07574
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| Research Institution | University of Yamanashi |
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Principal Investigator |
田中 智久 山梨大学, 大学院総合研究部, 助教 (30585310)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | HBV / エントリー / 阻害剤 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、HBVの機能性レセプターとして胆汁酸トランスポーター（NTCP）が同定され、培養細胞を用いた in vitro感染培養系の開発が容易になった。しかしながら、NTCPを過剰発現させた培養細胞が必ずしもHBVに対する感受性を獲得するわけではないことから、HBVのエントリーにはNTCP以外の何らかの未知の因子が関与することが示唆される。そこで本課題ではHBVエントリーに関与する新たな宿主因子を同定し、HBVエントリーの詳細な分子メカニズムを解明することを目的とた。HBVエントリーのメカニズム解明により新たなHBV治療薬の開発が可能になると考えられ、現在治療が困難な慢性B型肝炎に対する新たな治療薬開発につなげられると考えられる。
本年度では、予備スクリーニング実験から見出した宿主蛋白質がどのようにHBVエントリーに関与するかを明らかにするため、ゲノム編集技術を用いてノックアウト細胞を作製し、HBV、およびHDV（＝HBVシュードウイルス）に対するノックアウト細胞の感受性を解析した。これら解析の結果、本宿主因子欠損細胞では、これらウイルスに対する感受性が有意に低下する一方で、HBVやHCVの複製効率には影響を与えないことが分かった。このことから、同宿主因子はHBVのエントリーを制御する因子の一つであることが示唆された。また、本年度では、上記宿主因子の欠損変異体を作製し、NTCPとの相互作用や細胞内局在に必要となるドメイン領域を同定した。これらの成果より、HBVエントリーの分子メカニズムの一端を明らかにできたと考えられ、同宿主因子を標的とする新規HBV治療薬の開発の意義が明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度では、これまでに申請者が同定した宿主因子のHBVエントリーにおける役割を明かにすることを目的とし、同宿主因子の発現を欠損する培養細胞株を作製し、ウイルス感染における役割を解析した。また、同宿主因子の様々な変異体を作製し、NTCPとの相互作用に必要な領域を特定した。これら解析は計画通り順調に進行し、来年度以降の計画におおきな変更は生じなかった。
一方で、本年度ではNTCP複合体の精製によりHBVエントリーに関与する宿主因子の網羅的解析を行うことを計画していたが、回収タンパク質量が想定よりも少なくなり、新規因子を同定する解析を行うことができなかった。来年度以降では、NTCP複合体の回収効率を向上させるための条件検討を行うことで、上記の問題点を克服することが可能であると考えられる。
上記の二つの理由より、本研究は大幅な研究計画の修正を行う必要はなく、また、来年度以降の研究計画を進捗させることが可能であると考えられ、おおむね順調に進行していると考えた。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度の計画として、HBVエントリーの詳細な分子メカニズムを解明するため、本研究で注目する宿主因子とNTCPの相互作用の結果、どのような変化が細胞側・ウイルス側に生じているのかを解析する。具体的には、HBVエントリーに関与するEGFR蛋白質などのキナーゼに対する影響を明らかにするため、これら宿主因子のキナーゼ活性に対する影響を解析するとともに、HBVエンベロープやカプシド蛋白質への翻訳後修飾の有無を解析する。また、本年度の研究よりHBVエントリーに関与する宿主因子を同定できたと考えられるため、来年度以降では化合物ライブラリーを用いたHBVエントリー阻害剤の探索を行う。同様のスクリーニング実験は既に過去に行ったことがあり、大きな支障なく実施することができると考えている。また、本年度達成できなかったNTCP複合体の精製・解析については、NTCPの強い疎水性が影響していると考えられるため、界面活性剤や抽出条件を検討し、精製効率の改善を行った後、再試験する計画である。
研究計画については、当初の計画から大きく変更する点は特になく、これまでに計画した実験計画に従い、上記の計画を進行させることを予定している。
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