インフルエンザウイルス感染における好中球の役割の解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07590
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 今井 正樹 東京大学, 医科学研究所, 准教授 (30333363)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: A型インフルエンザウイルス感染 / 好中球 / 接着

Outline of Annual Research Achievements

重篤なウイルス性肺炎を呈した鳥インフルエンザ患者などの肺組織には浸潤した多数の好中球が観察されるが、好中球のインフルエンザウイルス性肺炎病態形成における役割は明らかにされていない。本研究では、感染細胞への好中球の接着がインフルエンザウイルスの排除に寄与しているのかどうかを明らかにするため、好中球と共培養した感染細胞におけるウイルスの増殖性を解析した。
インフルエンザウイルスはA/Puerto Rico/8/34 （H1N1）を用いた。好中球は健常者の末梢血から分離した。ヒト肺腺癌由来Ⅱ型肺胞上皮細胞A549細胞にPR8 をmultiplicity of infection (MOI) = 1 にて感染させた。感染後6時間目にA549細胞1個あたり10個の好中球を添加し培養した（接触条件）。また、直接的な細胞間接触を防ぐため、感染細胞を含むプレートにTranswellインサートを装填し、好中球をインサート内に添加して共培養した（非接触条件）。添加後3, 6, 18, 27及び42時間目に培養上清を回収した。上清中のウイルス力価は、MDCK細胞を用いたプラークアッセイ法により測定した。
非接触条件におけるウイルス力価は、添加後3, 6及び18時間目ではコントロール（好中球未添加）とほぼ同じであったが、27時間目と42時間目では有意に低下していた。一方、接触条件におけるウイルス力価は、いずれの時間においてもコントロールと比較して有意に低かった。以上の成績は、好中球は活性酸素種等の殺菌性因子を産生することでウイルスの増殖を抑えるだけでなく、感染細胞に直接接着することで、より効果的にウイルス増殖を抑制していることを示唆している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

A型インフルエンザウイルス感染マウス肺組織の炎症部位に浸潤した好中球の形態を走査型電子顕微鏡で観察した結果、多数の好中球が感染細胞に接着していることが代表研究者らの予備実験から明らかになった。しかし、この接着がどのような生物学的意義をもつのかは不明である。そこで令和元年度は、感染細胞への好中球の接着がウイルス排除に寄与しているのかどうかを明らかにするために、健常人から単離した好中球と共培養した感染細胞におけるウイルスの増殖性を調べた。その結果、好中球は感染細胞に直接接着することで、より効果的にウイルスの増殖を抑制していることが示唆された。このように当該年度において、インフルエンザウイルス感染における好中球の役割の一端を明らかにすることができた。

Strategy for Future Research Activity

引き続き、インフルエンザウイルス感染における好中球の役割を明らかにするために、令和2年度はインフルエンザウイルスを感染させたマウスの肺組織内における好中球と感染細胞との接着部位の微細構造を解析する。インフルエンザウイルスは蛍光タンパク質Venusの遺伝子を組み込んだA/Puerto Rico/8/34 (H1N1; PR8)（Venus-PR8）を用いる（Fukuyama et al., Nat Commun, 2015）。マウスはインフルエンザウイルス感染に対する感受性の高いC57BL/6Jマウスを用いる。蛍光標識抗Ly6G（好中球特異マーカー）抗体で免疫染色したウイルス感染肺組織から超薄切片を作製する。その切片を共焦点レーザー蛍光顕微鏡で観察して、Venus-PR8感染細胞（Venus陽性）と好中球（Ly6G陽性）を特定した後、同一視野の反射電子像を走査型電子顕微鏡で取得する。この反射電子像では超薄切片の透過型電子顕微鏡像と同等の構造情報が得られ、細胞膜や細胞内の微細な構造変化を明らかにすることができる。細胞接着部位の細胞膜とその膜直下の領域の構造変化に焦点を当て解析する。